コール酸フリー呼吸鎖複合体Ⅳ標品による進化で獲得した核由来サブユニットの機能解明

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呼吸鎖末端酸化酵素である複合体Ⅳは、酸素を水に還元すると共にプロトンを能動輸送する。最も進化した哺乳類酵素は、高度に保存された活性中心を含むミトコンドリアDNA由来の３つのコアサブユニットの周りを進化の過程で獲得した核DNA由来の10個の異なるサブユニットが取り囲んでいる。なぜ進化の過程で10種類ものサブユニットが付加されたのか？それらは、細胞環境に適応して複合体Ⅳによる呼吸活性制御にどのように影響を与えているのか？は基礎研究から医学的研究まで幅広い分野で興味がもたれる研究課題である。ウシ心筋複合体Ⅳの反応機構解明は、既に1.3Å分解能の構造情報を基に行われているが、核DNA由来サブユニットの機能は、解明されていない。その原因は、これまでの構造及び機能解明ではコール酸を用いて酵素を調製したため、酵素当たり10分子程度残存したコール酸が核DNA由来サブユニットと結合し、酵素機能を部分的に阻害すると共に生理活性物質等の結合を妨げていることによる。本研究では、コール酸を全く用いないで、活性が高く結晶化が可能な標品を収率よく得る精製法の改良を常に行っている。本酵素を用いた電子顕微鏡を用いた単粒子構造解析では、2.5Å分解能の構造を得るまでに至った。電顕用の試料調製の方法の改良により更なる分解能の向上を目指している。更に各種生理活性物質や、調節因子、薬剤との共構造を得るための条件検討を進めているが、残念ながら現段階では共構造は得られていない。高分解能構造の決定においてはX線結晶構造解析が優位である。そのため、結晶化条件を主にハンギングドロップ法により検討を進めている。角柱状の結晶を得ることはできているが、結晶構造を得るまでには至っていない。この３次元結晶化法の確立ができれば、リン酸化部位の検証や、制御因子のうち小分子であればソーキング法により導入可能となると考えられる。