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クライオ電子顕微鏡による細菌べん毛輸送中間複合体の構造解析

低温电子显微镜对细菌鞭毛转运中间复合物的结构分析

基本信息

批准号：
22K06162
负责人：
木下実紀
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06162/
关键词：
細菌電子顕微鏡蛋白質遺伝学感染症

项目摘要

べん毛輸送ゲート複合体は、水素イオンの内向きの流れに共役してべん毛構成タンパク質を細胞外へ送り出す。これまでに、熱揺らぎの影響を強く受けるにもかかわらず、輸送ゲート複合体にはべん毛構成タンパク質が高速かつ高効率に細胞外方向へのみ拡散移動できるしくみが装備されているが、その実体は未だ謎である。本研究では、クライオ電子顕微鏡を用い、輸送ゲート複合体部分を高分解能構造解析することで、熱揺らぎをうまく取り入れながら高速・高効率に輸送基質タンパク質を輸送できる輸送チャネル複合体の構造基盤を解明することを目的とする。本年度の主な成果は以下に示す。1.クライオ電子顕微鏡により、べん毛に組み込まれる前後でのFliPQR複合体の構造を明らかにした。組み込まれる前のFliPQR複合体は、可溶化の際に使用した界面活性剤をペプチドディスクに置き換えることで構造がより安定化され、今まで見えていなかったFliPのN末端領域の原子モデルを構築することができた。得られた構造に基づいて変異体解析を行なった結果、べん毛内部を貫通する輸送チャネルの形成メカニズムやMSリング内部にFliPQR複合体が組み込まれるしくみが明らかとなった。2.クライオ集束イオンビーム走査型電子顕微鏡を用いて、観察に適したサルモネラの薄層を作製する為の様々な条件検討を行った。まずは、サルモネラ菌体溶液の濁度と凍結条件を検討し、グリッド全体を覆い、かつ厚さが十分な層を持つグリッドを再現良く作製できるようになった。さらに、薄層を削る際のプログラムを最適化する為、電圧、ドーズ、ビーム径を検討した結果、約20分で1つの薄層を150μmまで薄く削る方法を確立した。

The hair transport complex is composed of an extracellular transport complex and an intracellular transport complex. The effects of heat and radiation are strongly affected by the heat and radiation, and the transport complex is composed of hair and mass. The high speed and high efficiency of extracellular direction and dispersion of the movement are not easy to understand. In this study, the use of electron micromirrors to transport complex components for high resolution energy structure analysis, thermal analysis, and access to high-speed, high-efficiency transport matrix components for mass transport, transport, and structural analysis of complex components were studied. The main results for the year are shown below. 1. The structure of FliPQR complex before and after electron microscope The FliPQR complex was previously used in the solubilization process to stabilize the structure of the interface. The results of the analysis of the structure of the FliPQR complex show that the formation of the FliPQR complex in the interior of the FliPQR complex is not easy. 2. The application and observation of cluster electron microscope for thin layer production are discussed. The turbidity and freezing conditions of the bacterial solution are discussed, and the thickness of the solution is reduced to 10%. In addition, the optimization method for thin layer cutting was established based on the results of the investigation of voltage, temperature and diameter of thin layer cutting in about 20 minutes