電気生理-蛍光変化同時計測系によるプロトンチャネルの制御機構解析

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申請者は、本研究開始前に膜電位に応じてプロトンを透過する電位依存性プロトンチャネルHv1において、細胞内側の“ATP”や“N末端ドメイン”が制御因子である可能性を見出した。そこで、Hv1の制御因子となる細胞内分子・ドメインの相互作用部位および作用メカニズムを明らかにすることを目的としている。本年度は、Hv1に対するATP効果の定量化を目的として、電気生理学的実験を実施した。ATPの効果を定量化するために、細胞膜から膜の一部を切り取ったインサイドアウト膜を形成した上で、細胞内側からATP濃度を調整しながら、Hv1のプロトン電流の計測を行った。その結果、生理的なATP濃度(2mM)で電流上昇効果があることが判明した。さらなる高濃度での測定も実施したが電流は上昇し続け、20mMでも飽和することはなかった(これ以上は測定できていない)。続いて、このATP効果が、直接的・間接的のどちらであるのか検討するために、ATPアナログによる電流への効果の定量を行った。ATPは、生体内で重要な生理作用をいくつも担うために他のイオンチャネルでは間接的な影響を与えることが多く(特にイノシトールリン脂質PI(4,5)P2の代謝に関わる)、このような評価は大変重要となる。Adenosine, AMP, ADP, ATPと効果を検証すると、リン酸基が多いものほど効果が大きいことが明らかとなった。また、ATPの代謝不活化型アナログであるAMP-PCPを用いた所、ATPと同等の効果が得られた。以上の事から、ATPはHv1に対して直接的に作用することで、影響を与えていると考えられた。