Finding of functional lncRNAs using newly developed RADCL-IP-seq technology

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ヒトでは約28,000種のノンコーディングRNA (ncRNA), 長鎖ncRNA (lncRNA)が存在するが、ほとんどの機能は明らかになっていない。機能が明らかなlncRNAではlncRNAがクロマチンに結合し、ポリコーム複合体をリクルートすることで高次クロマチン構造を形成する例が知られている。本研究ではRNAとクロマチンの相互作用をゲノムワイドに網羅的に検出する系であるRADICL-seq法を応用し、抗ヒストン修飾抗体などによる免疫沈降法と組み合わせる手法(RADICL-IP法)を開発し、染色体高次構造に重要な役割をもつRNAおよびlncRNAを探索する。本年度はRADICL-IP法プロトコールの開発を行なった。プロトコール開発にあたり必要な条件検討を行なった。プロトコールではDNase Iによるゲノムの切断を行ったのちアダプターを介し核内RNAとゲノムDNAをライゲーションさせ、免疫沈降前にソニケーションし核膜を破砕する。RNAはソニケーションに弱いため、ソニケーション条件の検討を行なった。また免疫沈降後の収量が少ないため、細胞数の検討、および使用する抗体の検討を行なったところ抗H3K27me3抗体では安定的にライブラリーを作成できることが明らかとなった。マウスES細胞を用いてinputおよびH3K27me3-RADICL-IPライブラリーを作成し、次世代シーケンサーMiseqを用いてライブラリーのクオリティチェックを行ったところ良好な結果が得られた。よってHiseqを用いて大量データを取得した。