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Finding of functional lncRNAs using newly developed RADCL-IP-seq technology

使用新开发的 RADCL-IP-seq 技术寻找功能性 lncRNA

基本信息

批准号：
22K06187
负责人：
加藤雅紀
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

ヒトでは約28,000種のノンコーディングRNA (ncRNA), 長鎖ncRNA (lncRNA)が存在するが、ほとんどの機能は明らかになっていない。機能が明らかなlncRNAではlncRNAがクロマチンに結合し、ポリコーム複合体をリクルートすることで高次クロマチン構造を形成する例が知られている。本研究ではRNAとクロマチンの相互作用をゲノムワイドに網羅的に検出する系であるRADICL-seq法を応用し、抗ヒストン修飾抗体などによる免疫沈降法と組み合わせる手法(RADICL-IP法)を開発し、染色体高次構造に重要な役割をもつRNAおよびlncRNAを探索する。本年度はRADICL-IP法プロトコールの開発を行なった。プロトコール開発にあたり必要な条件検討を行なった。プロトコールではDNase Iによるゲノムの切断を行ったのちアダプターを介し核内RNAとゲノムDNAをライゲーションさせ、免疫沈降前にソニケーションし核膜を破砕する。RNAはソニケーションに弱いため、ソニケーション条件の検討を行なった。また免疫沈降後の収量が少ないため、細胞数の検討、および使用する抗体の検討を行なったところ抗H3K27me3抗体では安定的にライブラリーを作成できることが明らかとなった。マウスES細胞を用いてinputおよびH3K27me3-RADICL-IPライブラリーを作成し、次世代シーケンサーMiseqを用いてライブラリーのクオリティチェックを行ったところ良好な結果が得られた。よってHiseqを用いて大量データを取得した。

There are about 28,000 kinds of RNA (ncRNA) and long-locked ncRNA (lncRNA) in the world. The function of lncRNA is to combine with lncRNA, to form complex, and to form high-order structures. In this study, we explored the interaction between RNA and RNA, the detection system of RNA and RNA, the use of RADICL-seq method, the development of anti-RNA modification antibody, the immunoprecipitation method and the combination method (RADICL-IP method), and the exploration of important RNA and RNA in chromosome high-order structure. This year, the RADICL-IP Law was launched. The necessary conditions are discussed. The DNA sequence of the DNA sequence of the DNA RNA is a very important component of the system. The number of cells detected and the use of anti-H3K27me3 antibodies were determined. The ES cell line is used to create the next generation of cells. Hiseq is used to obtain