B型肝炎ウイルス複製に関わるBcl-xL多量体化機構の解明と阻害剤の検討

乙型肝炎病毒复制中涉及的 Bcl-xL 多聚化机制的阐明和抑制剂的研究

• 批准号: 22K06574
• 负责人: 楠 英樹
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: National Institute of Infectious Diseases
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06574/
• 关键词: Bcl-xL; B型肝炎ウイルス; HBx; 多量体化

本研究では、HBxとBcl-xLが相互作用すると、Bcl-xLの多量体化を誘導し、Bcl-xL多量体がCa2+チャネルとして機能し、HBV複製を引き起こす可能性について検討することを目的としている。Bcl-xLの多量体の検出には、主に核磁気共鳴（NMR）法を用いている。本年度は、HBx BH3領域蛋白質に関して、大腸菌発現系を用いてワイルドタイプと数種の変異体の調製に成功した。Bcl-xLは既に調製方法を確立しており、必要に応じてBcl-xL蛋白質の精製を実施した。NMR解析を容易にするため、15Nで安定同位体標識したBcl-xLの調製を行った。また、膜模倣環境下でHBx BH3領域蛋白質（ワイルドタイプ）がBcl-xLに結合するとBcl-xLが多量体化すること、多量体化したBcl-xLに、結合親和性の高いリガンドを添加するとモノマーに戻り、そのリガンドと結合していることをNMR解析で確認した。今後は、この方法を用いて、さらに良いBcl-xL多量体化を阻害する低分子化合物を探索する予定である。Bcl-xL多量体化が、Bcl-xLとリガンドの結合親和性に関連するかを明らかにするため、等温滴定カロリーメトリー（ITC）解析でその結合親和性を調べた。数種のHBx BH3領域変異体とBcl-xLの結合親和性を決定することができた。その結果、HBx BH3領域変異体の中に、ワイルドタイプより強くBcl-xLと結合するタイプ、弱く結合するタイプ、ほぼ同じ結合親和性を示すタイプがあることが分かった。現在、結合親和性とBcl-xL多量体の関連性を調べている。また、HBx BH3領域変異体を用いて、Bcl-xLの多量体を誘導する上で必須となるアミノ酸を同定しているところである。

在这项研究中，我们旨在调查当HBX和Bcl-XL相互作用时，BCL-XL多聚化可以诱导BCL-XL多聚体，并且BCL-XL多聚体可以用作Ca2+通道并导致HBV复制。核磁共振（NMR）主要用于检测BCL-XL多聚体。今年，我们使用大肠杆菌表达系统成功制定了HBX BH3区域蛋白的野生类型和几种变体。已经建立了一种BCL-XL的制备方法，并在必要时纯化Bcl-XL蛋白。为了促进NMR分析，用15N的稳定同位素标记制备BCL-XL。此外，NMR分析证实，当HBX BH3区域蛋白（野生型）与膜模拟环境中与BCl-XL结合时，BCl-XL就会变得多种物质化，并且当具有高结合亲和力的配体添加到多层化的BCL-XL中时，它会返回到单体和粘合物中。将来，我们计划使用这种方法来寻找抑制BCL-XL多聚化的更好的低分子化合物。为了确定Bcl-XL多聚化是否与Bcl-XL和配体的结合亲和力有关，通过等温滴定热量metry（ITC）分析研究了其结合亲和力。能够确定几个HBX BH3区突变体和BCl-XL的结合亲和力。结果，发现在HBX BH3区域突变体中，有些类型结合Bcl-XL比野生类型，结合较弱的类型和表现出几乎相同的结合亲和力的类型。目前，我们正在研究结合亲和力与BCL-XL多聚体之间的关联。此外，HBX BH3区突变体已被用来鉴定诱导BCl-XL多聚体所必需的氨基酸。