Drug discovery through identification of microbial products against SARS-CoV-2 proteases

次世代のCOVID-19治療薬のバックアップを整備することは、薬剤耐性化や新たなコロナウイルスの出現に迅速に対応する上で重要である。本研究では、リード化合物創製の起点となる母核構造の提案を目指して、医薬品開発にインスピレーションを与えた天然物化合物に着目する。そこで、微生物培養液をソースとして、原因ウイルスのSARS-CoV-2に必須の２種のプロテアーゼを阻害する化合物を同定・最適化することを目的とする。初年度は当初の計画に沿って、（１）メインプロテアーゼ（Mpro）を阻害するヒット培養液中の活性成分の精製、（２）パパイン様プロテアーゼ（PLpro）のスクリーニング、および（３）各プロテアーゼの培養細胞評価系の構築を実施した。（１）研究開始時、培養液8,280サンプルのスクリーニングからMproを阻害する18サンプルを得ており、これらをC18逆相カラムにて分取した。活性分画について還元剤の影響やカテプシンBに対する選択性を評価し、有望なプロファイルを示す複数の培養液を見出した。（２）PLproについては培養液2,880サンプルをスクリーニングし、134サンプルのヒットを得た。次にパパインを用いたカウンターアッセイにより、選択性を示す19サンプルを見出した。（３）同定した（または精製途中の）活性成分の細胞での作用を評価するために、Mpro（またはPLpro）とスプリットNanoLuc（切断配列を挟み込んだルシフェラーゼレポーター）を共発現するプラスミドを構築した。Mpro発現プラスミドを293T細胞に導入した結果、NanoLucの切断による発光の低下を認めた。活性中心変異体では発光が維持したことから、Mpro特異的な切断が示された。一方、PLpro発現プラスミドでは、活性中心変異体でも複数の細胞株でNanoLucの切断が起こり、宿主プロテアーゼによる作用が示唆された。

次世代のCOVID-19治療薬のバックアップを整備することは、薬剤耐性化や新たなコロナウイルスの出現に迅速に対応する上で重要である。本研究では、リード化合物創製の起点となる母核構造の提案を目指して、医薬品開発にインスピレーションを与えた天然物化合物に着目する。そこで、微生物培養液をソースとして、原因ウイルスのSARS-CoV-2に必須の２種のプロテアーゼを阻害する化合物を同定・最適化することを目的とする。初年度は当初の計画に沿って、（１）メインプロテアーゼ（Mpro）を阻害するヒット培養液中の活性成分の精製、（２）パパイン様プロテアーゼ（PLpro）のスクリーニング、および（３）各プロテアーゼの培養細胞評価系の構築を実施した。（１）研究開始時、培養液8,280サンプルのスクリーニングからMproを阻害する18サンプルを得ており、これらをC18逆相カラムにて分取した。活性分画について還元剤の影響やカテプシンBに対する選択性を評価し、有望なプロファイルを示す複数の培養液を見出した。（２）PLproについては培養液2,880サンプルをスクリーニングし、134サンプルのヒットを得た。次にパパインを用いたカウンターアッセイにより、選択性を示す19サンプルを見出した。（３）同定した（または精製途中の）活性成分の細胞での作用を評価するために、Mpro（またはPLpro）とスプリットNanoLuc（切断配列を挟み込んだルシフェラーゼレポーター）を共発現するプラスミドを構築した。Mpro発現プラスミドを293T細胞に導入した結果、NanoLucの切断による発光の低下を認めた。活性中心変異体では発光が維持したことから、Mpro特異的な切断が示された。一方、PLpro発現プラスミドでは、活性中心変異体でも複数の細胞株でNanoLucの切断が起こり、宿主プロテアーゼによる作用が示唆された。