細胞分裂数を記録する人工遺伝子の開発

点击翻译按钮获取中文摘要

本研究は、さまざまな細胞において、細胞分裂数をモニタリングできる人工構築を開発することを目的とする。そのため、新たに、認識配列を容易に操作でき、多様な配列特異的組換えを誘導できる人工酵素を作成することが第一目標である。TN3 resolvaseのcatalitic domainに、転写因子egr1の３連のジンクフィンガー(ZF)DNA結合ドメインを融合させたタンパク質（TN3-L6-ZF3）の、大腸菌用の発現コンストラクトを作成した。また、二カ所の人工的組換えシグナルをもち、組換え反応をGFP蛍光喪失で検出できる標的構築を、p15Aオリのプラスミドで作成し、これらを用いて実際に組換え反応が、高率に起きること、また、３連のZFを一つもしくは二つ欠くと（TN3-L6-ZF2及びTN3-L6-ZF1）組換は全く起こらないことを確認した。次に、組換え標的配列の柔軟性を担保するために、TN3-L6-ZF1のC末端側にdCas9の配列をGGSリンカーを挟んで付加した発現プラスミドを作成した。dCas9用のsgRNAを2種同時に発現させるため、Lacプロモーター制御下に、自己切断能を持つribozymeの配列を挟んで２種類のsgRNAを発現するように設計したコンストラクトをpSC101オリを持つプラスミドで構築し、タンパク質とガイドRNAと組換え標的の三種プラスミドが併存して組換え反応を検出できる系を構築した。その結果、GFP喪失は顕著ではないが、PCR法による組換え検出により、想定通りに配列特異的組換が起こることが確認された。この結果は、新たに設計した人工組換え酵素は想定通り組換えを起こす事、また今後リンカー長やガイド位置などの細かい条件を検討して最適化を進める必要があるが、そのための系が構築できた、という事を示しており、計画実現に向けての重要な進歩である。