細胞分裂数を記録する人工遺伝子の開発

开发记录细胞分裂次数的人工基因

基本信息

批准号：
22K06898
负责人：
長岡仁
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06898/
关键词：
TN3 resolvase dCas9 DNA組換え細胞分裂人工遺伝子遺伝子組換え

项目摘要

本研究は、さまざまな細胞において、細胞分裂数をモニタリングできる人工構築を開発することを目的とする。そのため、新たに、認識配列を容易に操作でき、多様な配列特異的組換えを誘導できる人工酵素を作成することが第一目標である。TN3 resolvaseのcatalitic domainに、転写因子egr1の３連のジンクフィンガー(ZF)DNA結合ドメインを融合させたタンパク質（TN3-L6-ZF3）の、大腸菌用の発現コンストラクトを作成した。また、二カ所の人工的組換えシグナルをもち、組換え反応をGFP蛍光喪失で検出できる標的構築を、p15Aオリのプラスミドで作成し、これらを用いて実際に組換え反応が、高率に起きること、また、３連のZFを一つもしくは二つ欠くと（TN3-L6-ZF2及びTN3-L6-ZF1）組換は全く起こらないことを確認した。次に、組換え標的配列の柔軟性を担保するために、TN3-L6-ZF1のC末端側にdCas9の配列をGGSリンカーを挟んで付加した発現プラスミドを作成した。dCas9用のsgRNAを2種同時に発現させるため、Lacプロモーター制御下に、自己切断能を持つribozymeの配列を挟んで２種類のsgRNAを発現するように設計したコンストラクトをpSC101オリを持つプラスミドで構築し、タンパク質とガイドRNAと組換え標的の三種プラスミドが併存して組換え反応を検出できる系を構築した。その結果、GFP喪失は顕著ではないが、PCR法による組換え検出により、想定通りに配列特異的組換が起こることが確認された。この結果は、新たに設計した人工組換え酵素は想定通り組換えを起こす事、また今後リンカー長やガイド位置などの細かい条件を検討して最適化を進める必要があるが、そのための系が構築できた、という事を示しており、計画実現に向けての重要な進歩である。

这项研究旨在开发可以监测各种细胞中细胞分裂数量的人工结构。因此，主要目标是创建新的人工酶，该酶可以轻松地操纵识别序列并诱导各种序列特异性重组。为大肠杆菌（TN3-L6-ZF3）创建了大肠杆菌的表达构建体，其中转录因子EGR1的三锌指（ZF）DNA结合结构域被融合到TN3分辨率的催化域。此外，使用p15a质粒创建了具有两个人工重组信号的目标结构，并能够检测出GFP荧光丧失而能够检测重组反应，并且使用这些质粒可以证实重组反应实际上是高速率发生的，并且如果连续两次或两个连续的ZFS丢失了一个或两个连续的ZFS（TN33-L6-ZF）（TN33-L6-ZF2和TN3-L6-ZF2和TN33-ZF2和TN3-ZF2）。接下来，为了确保重组靶序列的灵活性，创建了表达质粒，其中DCAS9的序列被添加到带有GGS接头的TN3-L6-ZF1的C端。 In order to simultaneously express two types of sgRNA for dCas9, a construct designed to express two types of sgRNAs under the control of the Lac promoter was constructed with a plasmid with the self-cleavable ribozyme sequence sandwiched between the sequence of self-cleavable ribozyme, and a system in which the three types of plasmids, a protein, a guide RNA, and a recombinant target, were coexisted检测重组反应。结果，尽管GFP损失并不明显，但PCR的重组检测证实，序列特异性重组如预期的。这些结果表明，新设计的人工重组酶将按预期进行重组，并且在将来有必要考虑诸如接头长度和指导位置之类的详细条件以进行优化，但是为此目的创建了一个系统，这使得这是实现计划的重要进步。