細胞分裂数を記録する人工遺伝子の開発

开发记录细胞分裂次数的人工基因

• 批准号: 22K06898
• 负责人: 長岡 仁
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Gifu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06898/
• 关键词: TN3 resolvase; dCas9; DNA組換え; 細胞分裂; 人工遺伝子; 遺伝子組換え

本研究は、さまざまな細胞において、細胞分裂数をモニタリングできる人工構築を開発することを目的とする。そのため、新たに、認識配列を容易に操作でき、多様な配列特異的組換えを誘導できる人工酵素を作成することが第一目標である。TN3 resolvaseのcatalitic domainに、転写因子egr1の３連のジンクフィンガー(ZF)DNA結合ドメインを融合させたタンパク質（TN3-L6-ZF3）の、大腸菌用の発現コンストラクトを作成した。また、二カ所の人工的組換えシグナルをもち、組換え反応をGFP蛍光喪失で検出できる標的構築を、p15Aオリのプラスミドで作成し、これらを用いて実際に組換え反応が、高率に起きること、また、３連のZFを一つもしくは二つ欠くと（TN3-L6-ZF2及びTN3-L6-ZF1）組換は全く起こらないことを確認した。次に、組換え標的配列の柔軟性を担保するために、TN3-L6-ZF1のC末端側にdCas9の配列をGGSリンカーを挟んで付加した発現プラスミドを作成した。dCas9用のsgRNAを2種同時に発現させるため、Lacプロモーター制御下に、自己切断能を持つribozymeの配列を挟んで２種類のsgRNAを発現するように設計したコンストラクトをpSC101オリを持つプラスミドで構築し、タンパク質とガイドRNAと組換え標的の三種プラスミドが併存して組換え反応を検出できる系を構築した。その結果、GFP喪失は顕著ではないが、PCR法による組換え検出により、想定通りに配列特異的組換が起こることが確認された。この結果は、新たに設計した人工組換え酵素は想定通り組換えを起こす事、また今後リンカー長やガイド位置などの細かい条件を検討して最適化を進める必要があるが、そのための系が構築できた、という事を示しており、計画実現に向けての重要な進歩である。

The aim of this study is to develop a new type of artificial structure for cell division. The first objective is to create an artificial enzyme that is easy to manipulate and to induce. TN3 resolvase is composed of catalitic domain, coding factor egr1, 3-chain DNA binding domain, DNA fusion domain (TN3-L6-ZF3) and detection domain for Escherichia coli. The manual conversion of the two stations is carried out in the construction of the target, the p15A selection is made, and the conversion is carried out in the middle of the application. The conversion is carried out in the middle of the application. Second, the flexibility of the arrangement of the assembly target is guaranteed. The arrangement of dCas9 on the C terminal side of TN3-L6-ZF1 is guaranteed. Two types of sgRNA for dCas9 were simultaneously developed, Lac was controlled, and the two types of sgRNA were developed with the ability to maintain ribozyme alignment. Three types of sgRNA were developed with the ability to maintain ribozyme alignment. Results, GFP loss, PCR method, composition, identification, and alignment of specific compositions The result is a new design, manual assembly, enzyme optimization, system construction, project implementation, and important progress.