Functional elucidation of novel effectors of Legionella pneumophila approached through interactions with unique ciliate

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(1) 未知エフェクターの検出：作出済みのトランスポゾン挿入変異Legionella pneumophila (Lp) 菌株と繊毛虫Anteglaucomaの共培養実験を実施し、変異株全体(n=782)の約半数となるNo.360まで共培養実験を完了した。その結果、これまでに発見していた13株に加えて新たに11株の病原性喪失株（繊毛虫を殺滅しなくなった株）を選抜した。AP-PCR法とシークエンスによってこれら11株のトランスポゾン挿入部位を確認した結果、5株で特定に成功し、いずれもⅣ型分泌装置に関連するicm遺伝子（icmB, icmC, icmE, icmGのいずれか）が機能不全になっていたことがわかった。これらは繊毛虫に対するLpの病原性遺伝子だと考えられるが、LpがⅣ型分泌装置を介して宿主にエフェクター蛋白を注入することは既に判明しているので、今回発見した遺伝子はいずれも既知のメカニズム（Ⅳ型分泌装置依存的）に関連すると考えられ、未知の病原性遺伝子を発見するには至らなかった。(2) ヒト細胞への病原性を確認するためにHeLa細胞とLp変異株の共培養を実施した。研究計画調書の段階ではTHP-1細胞の使用を予定していたが、まずは培養が簡易なHeLa細胞でスクリーニングを実施することとしている。上記で新たに病原性遺伝子を特定した5株をHeLa細胞と共培養した結果、元株(Lp JR32)と比べて生細胞率が上昇した。また、Lp変異株は元株と比べてヒト細胞内での集塊形成（蛍光顕微鏡観察）と細胞内生菌数（培養・qPCR）が有意に減少しており、病原性遺伝子の喪失によってヒト細胞内での増殖能が失われたことが確認できた。以上を踏まえると、今回見出したLpの病原性因子は繊毛虫とヒト細胞の双方に作用するものであることが示された。