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Functional elucidation of novel effectors of Legionella pneumophila approached through interactions with unique ciliate

通过与独特纤毛虫的相互作用来阐明嗜肺军团菌新型效应子的功能

基本信息

批准号：
22K07051
负责人：
大久保寅彦
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07051/
关键词：
微生物間相互作用レジオネラ繊毛虫

项目摘要

(1) 未知エフェクターの検出：作出済みのトランスポゾン挿入変異Legionella pneumophila (Lp) 菌株と繊毛虫Anteglaucomaの共培養実験を実施し、変異株全体(n=782)の約半数となるNo.360まで共培養実験を完了した。その結果、これまでに発見していた13株に加えて新たに11株の病原性喪失株（繊毛虫を殺滅しなくなった株）を選抜した。AP-PCR法とシークエンスによってこれら11株のトランスポゾン挿入部位を確認した結果、5株で特定に成功し、いずれもⅣ型分泌装置に関連するicm遺伝子（icmB, icmC, icmE, icmGのいずれか）が機能不全になっていたことがわかった。これらは繊毛虫に対するLpの病原性遺伝子だと考えられるが、LpがⅣ型分泌装置を介して宿主にエフェクター蛋白を注入することは既に判明しているので、今回発見した遺伝子はいずれも既知のメカニズム（Ⅳ型分泌装置依存的）に関連すると考えられ、未知の病原性遺伝子を発見するには至らなかった。(2) ヒト細胞への病原性を確認するためにHeLa細胞とLp変異株の共培養を実施した。研究計画調書の段階ではTHP-1細胞の使用を予定していたが、まずは培養が簡易なHeLa細胞でスクリーニングを実施することとしている。上記で新たに病原性遺伝子を特定した5株をHeLa細胞と共培養した結果、元株(Lp JR32)と比べて生細胞率が上昇した。また、Lp変異株は元株と比べてヒト細胞内での集塊形成（蛍光顕微鏡観察）と細胞内生菌数（培養・qPCR）が有意に減少しており、病原性遺伝子の喪失によってヒト細胞内での増殖能が失われたことが確認できた。以上を踏まえると、今回見出したLpの病原性因子は繊毛虫とヒト細胞の双方に作用するものであることが示された。

(1)The co-culture of Legionella pneumophila (Lp) and Anteglaucoma was carried out, and about half of the total number of mutants (n=782) were co-cultured. The results showed that 13 new and 11 pathogenic plants were selected. AP-PCR method was used to identify the entry sites of 11 strains of icm, 5 strains of icm genes (icmB, icmC, icmE, icmG) associated with type IV secretory apparatus, and 5 strains of icm genes associated with type IV secretory apparatus. The pathogenic gene of Lp in caterpillars was detected by type IV secretion apparatus, and the host protein was injected into the host. It was found that the pathogenic gene was related to the known type IV secretion apparatus. (2)Co-culture of HeLa cells and Lp mutants was carried out to confirm the pathogenicity of HeLa cells. The phase of the study protocol was designed to determine the use of THP-1 cells and to culture them in a simple manner. The results of co-culture with 5 strains of HeLa cells showed that the cell growth rate of Lp JR32 increased. The number of endogenous bacteria (culture and qPCR) in the cells was intentionally reduced due to the loss of pathogenic genes and the loss of reproductive ability in the cells. The pathogenic factors mentioned above are shown to act on both sides of the caterpillar cell.