過去の細胞状態の記録による神経炎症ミクログリアの時空間的解析

通过记录过去的细胞状态对神经炎症小胶质细胞进行时空分析

基本信息

批准号：
22K07347
负责人：
永田健一
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

神経炎症は神経変性疾患や神経損傷に付随する免疫応答である。細胞の遺伝子発現は、炎症の惹起から収束までで大きく変化するため、特定のマーカーだけで炎症に関わる細胞の動態を追跡するのは困難である。そこで、本研究では過去に神経炎症を経験した細胞を継続的に標識できるマウスを作出し、神経炎症のプロセスを理解することを目指した。事前に実施していたシングルセルRNA-seqで同定した神経炎症マーカーCxcl10をCre挿入の標的とした。効率よく長鎖の配列をノックインするため、研究分担者である吉見一人博士が開発のCombi-CRISPR法（Hum Genet 2021 PMID: 32617796）を採用した。ジェノタイピングPCR、シークエンスによりCreの配列挿入を確認後、得られたFounderマウスを繁殖させ、Cre依存的に蛍光タンパクを継続的に発現するレポーターマウスと交配した。作製したマウスの片側舌下神経を損傷し、一定期間をおいて、脳の凍結切片を作製した。起始核である舌下神経核を観察したところ、蛍光タンパクの発現には非損傷側・損傷側間で明らかな差が認められた。炎症収束後にも、損傷側における蛍光タンパクの発現は維持されていたことから、神経炎症という過去のイベントの痕跡を組織中に保持するマウス系統が得られたと考えている。また、追加のシングルセルRNA-seqを実施するなどして、神経炎症の惹起から収束までの各ステージのマーカーを探索した。ミクログリアにおいては、炎症前、炎症時、炎症後とステージごとのユニークな分子マーカーが見つかっている。

神经炎症是与神经退行性疾病和神经损伤相关的免疫反应。由于细胞基因表达从诱导变为炎症的收敛，因此很难仅使用特定标记跟踪炎症中涉及的细胞动力学。因此，这项研究旨在创建可以连续标记过去经历过神经炎症的细胞的小鼠，并了解神经炎症的过程。使用已提前执行的单细胞RNA-seq鉴定的神经炎症标记CXCL10是针对CRE插入的。为了有效地敲击长链序列，研究员Yoshimi Hitoshi博士采用了由研究人员Yoshimi Hitoshi博士开发的Combi-Crispr方法（Hum Genet 2021 PMID：32617796）。通过基因分型PCR和测序确认了CRE序列的插入后，获得的创始人小鼠被繁殖，并用报告基因小鼠以Cre依赖性方式连续表达荧光蛋白。损坏了准备的小鼠的单侧降临神经，并在一段时间内制备了大脑的冷冻切除。当我们观察到是起源的降低神经核时，在未受损和受损的侧面之间的荧光蛋白表达存在明显差异。由于即使在炎症消退后仍保持荧光蛋白在受伤的侧面的表达，因此我们认为，保留了过去事件的痕迹的小鼠菌株在组织中获得了称为神经炎症的痕迹。此外，通过执行其他单细胞RNA-Seq搜索从诱导神经炎症到收敛的每个阶段的标记。在小胶质细胞中，已经发现了每个阶段的独特分子标记，例如炎症之前，期间和之后。