ALK陽性未分化大細胞リンパ腫におけるALK阻害剤耐性の機序解明と新規治療の開発

①「再発又は難治性ALK陽性未分化大細胞リンパ腫患者を対象としたCH5424802の第Ⅱ相試験（アレクチニブ医師主導治験）」に参加した小児・成人のうち、腫瘍の保存検体が確保できた9症例においてリンパ腫生検組織（パラフィン包埋ブロック；FFPE）を収集した。FFPE標本の病理組織像について、山口大学分子病理学　伊藤浩史（研究協力者）と共同で確認を行い、FFPE標本から腫瘍細胞のDNAを抽出した。② ①で抽出したDNAを用いて、ALK遺伝子のエクソン23、24、25領域のDNAをpolymerase chain reaction (PCR) にて増幅し、サンガー法によるダイレクトシーケンスを行った後に塩基配列を確認した。エクソン23領域では良好にDNAの増幅を認めたが、アレクチニブ耐性を示した症例に特異的な遺伝子変異を認めなかった。エクソン24、25についてはPCRでDNAを増幅したが、ノイズが多く発生したため塩基配列の特定が困難であった。ダイレクトシーケンスでは変異細胞のバリアントアリル頻度が低い場合は変異を検出できないことを考慮して、次世代シーケンサーによるアンプリコンシーケンス解析を行った。③ ALK遺伝子の全領域にあたるエクソン1から29までを増幅し、ライブラリー作製した後にアンプリコンシーケンス解析を行った。アレクチニブを投与中に再発を認めた際に腫瘍組織生検を実施した1症例において、アレクチニブが結合するチロシンキナーゼドメイン内に十分なread countを有するアミノ酸変異を伴う遺伝子変異を認めた。この変異のVAFは24%であり、read countとともに適正に解析が行われていることを示していると判断した。この変異とALK阻害薬の感受性に関する報告はこれまでになく、新しい知見である可能性が考えられた。

①「再発又は難治性ALK陽性未分化大細胞リンパ腫患者を対象としたCH5424802の第Ⅱ相試験（アレクチニブ医師主導治験）」に参加した小児・成人のうち、腫瘍の保存検体が確保できた9症例においてリンパ腫生検組織（パラフィン包埋ブロック；FFPE）を収集した。FFPE標本の病理組織像について、山口大学分子病理学　伊藤浩史（研究協力者）と共同で確認を行い、FFPE標本から腫瘍細胞のDNAを抽出した。② ①で抽出したDNAを用いて、ALK遺伝子のエクソン23、24、25領域のDNAをpolymerase chain reaction (PCR) にて増幅し、サンガー法によるダイレクトシーケンスを行った後に塩基配列を確認した。エクソン23領域では良好にDNAの増幅を認めたが、アレクチニブ耐性を示した症例に特異的な遺伝子変異を認めなかった。エクソン24、25についてはPCRでDNAを増幅したが、ノイズが多く発生したため塩基配列の特定が困難であった。ダイレクトシーケンスでは変異細胞のバリアントアリル頻度が低い場合は変異を検出できないことを考慮して、次世代シーケンサーによるアンプリコンシーケンス解析を行った。③ ALK遺伝子の全領域にあたるエクソン1から29までを増幅し、ライブラリー作製した後にアンプリコンシーケンス解析を行った。アレクチニブを投与中に再発を認めた際に腫瘍組織生検を実施した1症例において、アレクチニブが結合するチロシンキナーゼドメイン内に十分なread countを有するアミノ酸変異を伴う遺伝子変異を認めた。この変異のVAFは24%であり、read countとともに適正に解析が行われていることを示していると判断した。この変異とALK阻害薬の感受性に関する報告はこれまでになく、新しい知見である可能性が考えられた。