低ホスファターゼ症病態形成新規メカニズム－細胞外リンのシグナル及びATPの関与－

低磷酸酯酶症发病机制的新机制 - 细胞外磷信号和 ATP 的参与 -

• 批准号: 22K07837
• 负责人: 山崎 美和
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Osama Woman's and Children's Hospital
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07837/
• 关键词: TNSALP; Phosphate; 低ホスファターゼ症; リン

組織非特異型アルカリホスファターゼ（TNSALP）は骨芽細胞などの形質膜に存在するectoenzymeであり、ピロリン酸などの基質を分解して無機リン酸を産生する。低ホスファターゼ症 (HPP) はTNSALPをコードするALPL遺伝子の機能喪失に基づき、骨石灰化障害や乳歯早期脱落など多彩な症状を呈するが、病態形成機構は完全には理解されていない。本研究においては、健常人由来iPS細胞にCRISPR/Cas9によるゲノム編集を適用してALPL-knockout (KO)細胞を樹立し、骨芽細胞系列に分化誘導して解析することにより、HPPの病態形成機構を解明することを目的とした。健常人由来iPS細胞株にALPLのexon 3とexon 4内の標的配列に対する合成guide RNAとCas9蛋白質を導入し、欠失およびフレームシフトが誘導されたクローンを選定した。ALPL-KOにおいてはTNSALP酵素活性は完全に喪失しており、一方、ALPL-hetero KOにおいてはALPL以外は遺伝的に同質なisogenic controlの半分程度の残存酵素活性を保持していた。リン酸供与体としてbグリセロリン酸を含む骨芽細胞分化誘導培地を用いて８週間まで培養し、経時的にアリザリンレッド染色を行ってin vitro石灰化能を評価したところ、ALPL-KOにおいては培養期間を通じて石灰化が著明に抑制されていた。一方、ALPL-hetero KOにおいては、培養２週目以降、isogenic controlと同等の石灰化を示した。興味深いことに、分化誘導時、ALPL-KO iPS細胞では石灰化の障害にも関わらず、isogenic controlに比しRUNX2やosteopontinの発現が増加していた。

Tissue independent protein synthesis (TNSLP) is responsible for the production of extracellular enzymes, inorganic acids and substrates in the plasma membrane of bone bud cells Low Profile Disease (HPP) is a disease in which ALPL gene function is lost due to TNSLP, bone calcification, early tooth loss, and polychromatic symptoms are present and the mechanism of disease formation is fully understood. The purpose of this study is to elucidate the mechanism of CRISPR/Cas9 differentiation in healthy individuals derived from iPS cells, and to elucidate the mechanism of differentiation in ALPL-knockout (KO) cells. Healthy people were selected for the induction of synthetic guide RNA and Cas9 protein in the target alignment of ALPL exon 3 and exon 4 from iPS cell lines ALPL-KO enzyme activity is completely lost, and ALPL-hetero KO enzyme activity is maintained to a lesser extent than ALPL enzyme activity. The cell differentiation induction culture was conducted by acid supply and in vitro culture. The cell differentiation was inhibited by ALPL-KO during culture. One side, ALPL-hetero KO The expression of calcareous, isogenic and osteopontin in ALPL-KO iPS cells increased during induction and differentiation.