低ホスファターゼ症病態形成新規メカニズム－細胞外リンのシグナル及びATPの関与－

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組織非特異型アルカリホスファターゼ（TNSALP）は骨芽細胞などの形質膜に存在するectoenzymeであり、ピロリン酸などの基質を分解して無機リン酸を産生する。低ホスファターゼ症 (HPP) はTNSALPをコードするALPL遺伝子の機能喪失に基づき、骨石灰化障害や乳歯早期脱落など多彩な症状を呈するが、病態形成機構は完全には理解されていない。本研究においては、健常人由来iPS細胞にCRISPR/Cas9によるゲノム編集を適用してALPL-knockout (KO)細胞を樹立し、骨芽細胞系列に分化誘導して解析することにより、HPPの病態形成機構を解明することを目的とした。健常人由来iPS細胞株にALPLのexon 3とexon 4内の標的配列に対する合成guide RNAとCas9蛋白質を導入し、欠失およびフレームシフトが誘導されたクローンを選定した。ALPL-KOにおいてはTNSALP酵素活性は完全に喪失しており、一方、ALPL-hetero KOにおいてはALPL以外は遺伝的に同質なisogenic controlの半分程度の残存酵素活性を保持していた。リン酸供与体としてbグリセロリン酸を含む骨芽細胞分化誘導培地を用いて８週間まで培養し、経時的にアリザリンレッド染色を行ってin vitro石灰化能を評価したところ、ALPL-KOにおいては培養期間を通じて石灰化が著明に抑制されていた。一方、ALPL-hetero KOにおいては、培養２週目以降、isogenic controlと同等の石灰化を示した。興味深いことに、分化誘導時、ALPL-KO iPS細胞では石灰化の障害にも関わらず、isogenic controlに比しRUNX2やosteopontinの発現が増加していた。