低ホスファターゼ症病態形成新規メカニズム－細胞外リンのシグナル及びATPの関与－

低磷酸酯酶症发病机制的新机制 - 细胞外磷信号和 ATP 的参与 -

• 批准号: 22K07837
• 负责人: 山崎 美和
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Osama Woman's and Children's Hospital
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07837/
• 关键词: TNSALP; Phosphate; 低ホスファターゼ症; リン

組織非特異型アルカリホスファターゼ（TNSALP）は骨芽細胞などの形質膜に存在するectoenzymeであり、ピロリン酸などの基質を分解して無機リン酸を産生する。低ホスファターゼ症 (HPP) はTNSALPをコードするALPL遺伝子の機能喪失に基づき、骨石灰化障害や乳歯早期脱落など多彩な症状を呈するが、病態形成機構は完全には理解されていない。本研究においては、健常人由来iPS細胞にCRISPR/Cas9によるゲノム編集を適用してALPL-knockout (KO)細胞を樹立し、骨芽細胞系列に分化誘導して解析することにより、HPPの病態形成機構を解明することを目的とした。健常人由来iPS細胞株にALPLのexon 3とexon 4内の標的配列に対する合成guide RNAとCas9蛋白質を導入し、欠失およびフレームシフトが誘導されたクローンを選定した。ALPL-KOにおいてはTNSALP酵素活性は完全に喪失しており、一方、ALPL-hetero KOにおいてはALPL以外は遺伝的に同質なisogenic controlの半分程度の残存酵素活性を保持していた。リン酸供与体としてbグリセロリン酸を含む骨芽細胞分化誘導培地を用いて８週間まで培養し、経時的にアリザリンレッド染色を行ってin vitro石灰化能を評価したところ、ALPL-KOにおいては培養期間を通じて石灰化が著明に抑制されていた。一方、ALPL-hetero KOにおいては、培養２週目以降、isogenic controlと同等の石灰化を示した。興味深いことに、分化誘導時、ALPL-KO iPS細胞では石灰化の障害にも関わらず、isogenic controlに比しRUNX2やosteopontinの発現が増加していた。

Organization fit different ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ (TNSALP) は bone bud cells な ど の form plasma membrane に exist す る ectoenzyme で あ り, ピ ロ リ ン acid な ど を の matrix decomposition し て inorganic リ ン acid を produce す る. Low ホ ス フ ァ タ ー ゼ syndrome (HPP) は TNSALP を コ ー ド す る ALPL heritage 伝 son function の lost に base づ き, bone calcification handicap of や milk 歯 early shedding な ど colorful な symptoms を is す る が agency, pathological formation は completely に は understand さ れ て い な い. This study に お い て は origins, the healthy human iPS cells に CRISPR/Cas9 に よ る ゲ ノ compiling を ム applicable し て ALPL - knockout (KO) cells を set series に し, bone bud cell differentiation induced し て parsing す る こ と に よ り, HPP の pathological form institutions を interpret す る こ と を purpose と し た. The healthy human origin iPS cell lines に ALPL の exon 3 と in exon 4 の mark with column に す seaborne る guide RNA synthesis と Cas9 protein を import し, owe lost お よ び フ レ ー ム シ フ ト が induced さ れ た ク ロ ー ン を selected し た. ALPL - KO に お い て は TNSALP loss of enzyme activity was completely に は し て お り, one party, ALPL - hetero KO に お い て は ALPL は outside but 伝 に homogenous な isogenic control の half degree の residual enzyme activity was を し て い た. リ ン acid body and supply と し て b グ リ セ ロ リ を ン acid containing む bone bud differentiation inducing the petty を with い ま between て 8 weeks で cultivate し, 経 に ア リ ザ リ ン レ ッ ド dyeing line を っ て in vitro calcification can を review 価 し た と こ ろ, ALPL - KO に お い て は training during を tong じ て calcification が zhao Ming に inhibit さ れ て い た. One side, ALPL-hetero KOにお にお て て, cultured for 2 weeks or less, isogenic controlと equivalent, <s:1> callization を shows た. Interest as deep い こ と に, induced differentiation and ALPL - KO iPS cells で は calcification の handicap of に も masato わ ら ず, isogenic control に than し RUNX2 や osteopontin の 発 now が raised し て い た.