チェックポイント分子HIF1αをゲノム編集したNK細胞による膠芽腫治療法の開発

使用带有基因组编辑检查点分子 HIF1α 的 NK 细胞开发胶质母细胞瘤治疗

• 批准号: 22K09213
• 负责人: 中澤 務
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Nara Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K09213/
• 关键词: 膠芽腫; NK細胞; CRISPR/Cas9; HIF1α

本研究の目的はチェックポイント分子HIF-1α遺伝子をCRISPR/Cas9で破壊したゲノム編集NK細胞を体外で誘導し、膠芽腫に対する抗腫瘍効果の解析や臨床応用に寄与できる細胞特性解析を行うことである。本年度は以下の実験を行った。①guide RNAの設計：HIF-1α遺伝子のゲノム編集に必要な2種類のguide RNAを設計し、同時にそのオフターゲット配列の候補も3種類程度予測した。② ゲノム編集NK細胞の誘導：末梢血単核細胞よりT細胞を除去後、7日間培養。培養後のNK細胞にguide RNA/Cas9複合体を導入し、NK細胞の増殖率を評価した。③ ゲノム編集効果の検証：培養後のゲノム編集NK細胞のHIF-1αの発現阻害効果をウェスタンブロット法を用いて検証した。また、PCR法を用いてゲノムDNAに対するオンターゲット、オフターゲット効果を確認した。④ ゲノム編集NK細胞の網羅的遺伝子発現解析：ゲノム編集後に目的以外の遺伝子の発現に影響があるかどうかを確認するために、NK細胞に発現する活性化受容体やチェックポイント受容体の発現解析を行うためのデータ取得を行った。現在、Clariom SによるマイクロアレイとTAC (Transcriptome Analysis　Console)を用いて遺伝子発現解析、KEGGパスウェイ解析、DAVIDやGSEAによるエンリッチメント解析を実施中である。

The aim of this study was to compile NK cells for induction in vitro, analysis of anti-tumor effects, clinical application and characterization of NK cells using CRISPR/Cas9 as a vector for HIF-1α. This year, the following measures were taken. (1) Guide RNA design: HIF-1 alpha gene must be compiled for the design of two types of guide RNA, and at the same time, three types of candidate RNA must be predicted. 2. NK cell induction: peripheral blood mononuclear cells and T cells were removed and cultured for 7 days. NK cell guide RNA/Cas9 complexes were introduced after culture and NK cell proliferation was evaluated. (3) To compile the experimental results: After culture, to compile the experimental results of HIF-1α inhibition of NK cells, and to use the method of cell culture. The PCR method was used to confirm the DNA sequence. (4) Analysis of gene expression of NK cell network: The influence of gene expression other than the target after compilation is confirmed, and the activation of NK cell receptor and the analysis of gene expression of NK cell are obtained. Now, Clariom S is in the process of being implemented by using the Transcriptome Analysis Console (TAC) to analyze the occurrence of the virus, KEGG, DAVID and GSEA.