チェックポイント分子HIF1αをゲノム編集したNK細胞による膠芽腫治療法の開発

使用带有基因组编辑检查点分子 HIF1α 的 NK 细胞开发胶质母细胞瘤治疗

• 批准号: 22K09213
• 负责人: 中澤 務
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Nara Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K09213/
• 关键词: 膠芽腫; NK細胞; CRISPR/Cas9; HIF1α

本研究の目的はチェックポイント分子HIF-1α遺伝子をCRISPR/Cas9で破壊したゲノム編集NK細胞を体外で誘導し、膠芽腫に対する抗腫瘍効果の解析や臨床応用に寄与できる細胞特性解析を行うことである。本年度は以下の実験を行った。①guide RNAの設計：HIF-1α遺伝子のゲノム編集に必要な2種類のguide RNAを設計し、同時にそのオフターゲット配列の候補も3種類程度予測した。② ゲノム編集NK細胞の誘導：末梢血単核細胞よりT細胞を除去後、7日間培養。培養後のNK細胞にguide RNA/Cas9複合体を導入し、NK細胞の増殖率を評価した。③ ゲノム編集効果の検証：培養後のゲノム編集NK細胞のHIF-1αの発現阻害効果をウェスタンブロット法を用いて検証した。また、PCR法を用いてゲノムDNAに対するオンターゲット、オフターゲット効果を確認した。④ ゲノム編集NK細胞の網羅的遺伝子発現解析：ゲノム編集後に目的以外の遺伝子の発現に影響があるかどうかを確認するために、NK細胞に発現する活性化受容体やチェックポイント受容体の発現解析を行うためのデータ取得を行った。現在、Clariom SによるマイクロアレイとTAC (Transcriptome Analysis　Console)を用いて遺伝子発現解析、KEGGパスウェイ解析、DAVIDやGSEAによるエンリッチメント解析を実施中である。

这项研究的目的是诱导基因组编辑的NK细胞，这些NK细胞已在体外用CRISPR/CAS9的检查点分子HIF-1α基因破坏，并分析针对胶质母细胞瘤和细胞表征的抗肿瘤作用，这可能有助于临床应用。今年，我们进行了以下实验：1。指导RNA设计：设计了HIF-1α基因的基因组编辑所需的两种类型的指导RNA，同时预测了大约三种类型的非目标序列候选者。 ②诱导基因组编辑的NK细胞：从外周血单核细胞中去除T细胞后，培养了7天。培养后，将引导RNA/Cas9复合物引入NK细胞中，并评估了NK细胞的增殖速率。 ③基因组编辑效应的验证：使用蛋白质印迹验证培养后HIF-1α表达在基因组编辑NK细胞中的抑制作用。此外，使用PCR证实了靶标和靶点对基因组DNA的影响。 ④获得基因组编辑的NK细胞的全面基因表达分析：获取数据以分析在NK细胞中表达的活化受体和检查点受体的表达，以确认基因组编辑后靶标以外的基因表达是否存在影响。目前，使用微阵列和TAC（转录组分析控制台）使用David和GSEA使用David和GSEA进行基因表达分析，KEGG途径分析和富集分析。