Runx1による造血幹細胞産生メカニズムの解明

阐明Runx1产生造血干细胞的机制

基本信息

批准号：
26460375
负责人：
山元康敏
金额：
$ 3.24万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-26460375/
关键词：
Runx1 ノンコーディングRNA

项目摘要

Runx1による造血幹細胞産生メカニズムの解明を目的として、新規Runx1依存性分子の機能解析を行った。ES細胞分化（胚様体形成）モデルの網羅的遺伝子解析により得られた、種々のRunx1依存性分子の中で、特に発現変化が顕著であったノンコーディングRNAに着目し、以下の検討を行った。（１）Runx1による本遺伝子（ノンコーディングRNA）発現変化をリアルタイムPCRにて相対定量比較を行った検討で、ES細胞レベルで野生型と比較してRunx1ノックアウトでは極めて顕著な発現低下を認めることを、これまで報告してきた。今回さらに、Runx1ノックインによりノックアウト時に認めた発現低下がレスキューされることを確認した。（２）本遺伝子の転写開始点上流近傍は比較的に種を越えて保存されており、in silico解析によりRunx1結合部位が確認された。そこで、Runx1による転写活性化能をルシフェラーゼアッセイにて検討した。本遺伝子のプロモーター領域とされる、Runx1結合部位を含む転写開始点上流に位置する種々の長さのDNA断片を用いてノンコーディングRNA遺伝子プロモーター含有ルシフェラーゼアッセイベクターを作成した。次いで、60mm dishおよび24-well plateに播種したHela細胞に対し、カルシウム沈降法、リポフェクション法によりRunx1発現プラスミドとルシフェラーゼベクターを導入し、48時間後にルシフェラーゼアッセイを行った。条件により、（程度は小さいながら）Runx1により本遺伝子の転写は正に活性化された。以上より、本遺伝子（ノンコーディングRNA）はRunx1依存性に発現制御され、メカニズムの一つとしてRunx1が本遺伝子のプロモーター領域に結合し正に発現を制御する可能性が示唆された。

为了阐明Runx1产生造血干细胞的机制，对新型Runx1依赖性分子进行了功能分析。在通过对ES细胞分化（胚胎体形成）模型的综合遗传分析获得的各种Runx1依赖性分子中，进行了以下研究，重点是非编码RNA，这在表达中具有特别重大的变化。（1）我们以前已经报道说，与RUNX1相比，与ES细胞水平的野生型相比，Runx1敲除表达的显着降低明显更大。此外，我们确认Runx1敲入可以挽救在淘汰赛时观察到的表达下降。（2）该基因的转录起源的上游侧相对保守，在计算机分析中证实了Runx1结合位点。因此，使用荧光素酶测定法研究了通过RUNX1激活转录的能力。非编码RNA基因启动子荧光素酶测定矢量是使用位于转录起始点上游的各种长度的DNA片段（是该基因的启动子区域）创建的，并包含Runx1结合位点。接下来，通过钙降水和脂肪触摸引入了60毫米盘中的HeLa细胞，并在Runx1表达质粒和荧光素酶载体中引入了24孔板，并在48小时后进行了荧光素酶测定。根据条件的不同，该基因的Runx1（尽管程度很小）被积极地激活。从以上，已经提出，该基因（非编码RNA）以RUNX1依赖性方式表达，并且Runx1可以与该基因的启动子区域结合，并调节其表达作为其机制之一。