体液中の病原微生物の定量的計測法に関する研究

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細菌数を培養せずに計測することを目標とした本研究は液体に浮遊させた細菌の数をレーザー蛍光顕微鏡及びフローサイトメーターの最新技術を利用して定量することを目指した。1ミクロン前後の大きさの細菌を拡散光で分析する際の問題点は、非生物系の微粒子を除くことにあったが、生物粒子はエラスターゼと蛍光基質、死菌はDNAを染めるエチジウムブロマイドを使用することで解決できた。従来型のフローサイトメーターでは、粒子の経が数ミクロン以上なければ正確な計測はできなかった。従来型はキャピラリー管の中を細胞が通過する際に生じる散乱光をもとに計測していたが、この方法を膜面に粒子を含んだ液体をふきつけ、その表面を流れ落ちる粒子を測定する新しいタイプのフローサイトメーターを使用すれば、0.2ミクロンの大きさまで計測できることがわかった。従って生命体をエラスターゼで選択し、その中の粒子を測定することで0.5ミクロン以上ある一般細菌の総数を計測できることがわかった。一方、レーザー蛍光顕微鏡を使用した測定では生命体をエラスターゼで測定し、死滅した細菌粒子をエチジウムブロマイドで染める方法を組み合わせることで液体中に存在する細菌数、その中の生菌数、及び死菌数を定量できることがわかった。この方法をモノクローン抗体で染める方法と組み合わせることで、液体中の特定の病原体数の計測もできることから、培養せずに料中の細菌総数、死菌数、特定病原体数の3種類の計測が同時に実施できることがわかった。しかしレーザー顕微鏡で菌数を測定する場合、50倍から200倍に視野を拡大するため材料中の病原体数は50×10^3/mm^3以上なければ正確な定量が困難であった。従って、この方法を臨床材料に応用するために濃縮方法を組み合わせる工夫を行い、態度を上げる必要があった。