デアミノノイラミン酸残基特異的な新規シアリダーゼ(KDNase)-酵素の化学構造および立体構造の解析と既知シアリダーゼとの比較

新型脱氨基神经氨酸残基特异性唾液酸酶 (KDNase) - 分析酶的化学和三级结构并与已知唾液酸酶进行比较

• 批准号: 08878090
• 负责人: 北島 健
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08878090/
• 关键词: KDN; KDNアーゼ; シアリダーゼ; 誘導酵素; 分子クローニング; 細菌酵素; 酵素反応速度論的解析; 結晶構造解析

既知のシアリダーゼに抵抗性を示すKDN(デアミノノイラミン酸)残基を特異的に加水分解する酵素(KDNase)は、シアル酸炭素骨格の5位の水酸基とアミノアシル基を厳密に区別する。本研究は、このシアル酸識別機構をKDNaseの触媒反応機構と化学および立体構造的見地から解明することを目的として行い、以下の結果を得た。1.KDNaseSMの速度論的解析:精製酵素を用い、酵素反応の速度論的解析を合成および天然基質、また阻害剤を用いて行うとともに、基質の加水分解反応におけるKDNの立体配置の経時変化をNMRによって分光学的に追跡した。その結果、KDNaseは、炭素骨格の5位の置換基の認識が厳密であるものの、従来のシアリダーゼ触媒と同様の遷移状態を経由する共通の反応機構が存在することが明らかになった。2.Sphingobacterium multivorum由来KDNaseSMの分子クローニングと化学構造解析:精製酵素の部分アミノ酸配列を決定する。このアミノ酸配列から推定される合成オリゴヌクレオチド・プローブをもちいて、酵素をコードするcDNAをスクリーニングし、更にそのcDNAの塩基配列決定を行った。現在、ほぼ全アミノ酸配列の推定が成功したところである。明らかにされたアミノ酸配列の範囲内では、既知のシアリダーゼのアミノ酸配列との相同性はあまり見出されていない。3.KDNaseSMの結晶構造解析を目指した酵素の大量調製:KDNaseは、誘導酵素であり、KDNのαケトシドによって、S.multivorum中に誘導されることが確かめられた。現在、(2)で得られたcDNAから酵素を大腸菌に発現させて、酵素に対する抗体を調製中であり、抗体を用いた1段階精製法を確立を目指しているところである。

It is known that the resistance of KDN residues in KDN (デアミノノイラミン acid) residues is specific for hydrolysis. The difference between the enzyme (KDNase) and the 5-position water acid base of the saccharine carbonate structure is the saccharyl base. The purpose of this study was to gain insight into the chemical three-dimensional structure of the acid recognition mechanism of KDNase, the catalytic reaction mechanism of KDNase, and the purpose of the study, and the following results were obtained. 1. Analysis of the speed theory of KDNaseSM: analysis of the use of refined enzymes, analysis of the speed theory of enzyme reaction, synthesis of natural substrates, and prevention of harmful substances Use the いて行うとともに, the matrix のhydrolytic reaction におけるKDN and the three-dimensional configuration の経time change をNMR によって spectroscopic に tracing した. The results of その, KDNase は, the 5-position substitution base of carbon bone structure, the understanding of が厳mi, であるものの, 従来のシアリダーゼcatalyst と Same 様 の transfer state を経 by the する通のreaction mechanism が existence することが明らかになった. 2. Origin of Sphingobacterium multivorum: Analysis of the chemical structure of KDNaseSM's molecular molecule: the purified enzyme part is determined by the acid sequence.このアミノから presumed されるsynthetic オリゴヌクレオチド・プローブをもちいて, enzymeをコードするcDNAをスクリーニングし, and more にそのcDNAの塩行った. Now, it is estimated that all ほぼアミノ acid combinations are successful. Ming らかにされたアミノ acid combination の法囲内では, known のシアリダはあまり见出されていない. 3. Analysis of the crystal structure of KDNaseSM and large-scale preparation of enzymes: KDNase and induced enzymes.り、KDNのαケトシドによって、S. Now, (2) でget られたcDNA からEnzyme を coliform に発appear させて, enzyme に対するanti The body preparation method and antibody preparation method are established using the one-stage purification method.

项目成果

北島,健: "新しいシアル酸KDNの糖鎖生物学の最近の発展" 生化学. 68(1). 44-51 (1997)

Kitajima，Ken：“新唾液酸 KDN 糖生物学的最新进展”，生物化学 68(1) (1997)。