スターベーション法によるブタ精子の先体反応誘起機序の解明に関する研究

饥饿法阐明猪精子顶体反应诱导机制的研究

• 批准号: 08760261
• 负责人: 楠 比呂志
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760261/
• 关键词: ブタ; 精子; 先体反応; スターベーション法; カルシウムイオン

研究代表者が考案したスターベーション(以下SVと略記)法は、精子を代謝基質と酸素が不足する状態に置いてATPを枯渇させることで先体反応を誘起させる方法で、ヤギ、ウシ、ブタ、ヒトおよびグレビーシマウマで有効性を確認している。本研究では、SV法による先体反応誘起機序を解明する目的で、精子内外のCa^<2+>の関わりについてブタを材料として調べた。すなわち、妊孕能が明らかな3頭の成熟雄から得た新鮮射出精子を材料とし、精子内外のCa^<2+>が欠乏または充足する条件下で5時間までSV処理(精子を代謝基質を含まない媒液に10億/ml以上の濃度で浮遊して密閉容器内において40℃で加温)を行った後に、先体反応誘起の程度をトリパンブルー・ギムザ染色法と透明帯除去ブタ卵子を用いた配偶子融合試験により経時的に調べた。なお、Ca^<2+>充足条件下と外欠乏条件下でのSV処理では、媒液にそれぞれ2 mM CaCl2と1 mM EGTAを添加したNaCl/TES緩衝液を使用した。また内欠乏条件下では、SV処理に先だって精子にBAPTA/AMをpre-loadした。まず精子内ATP量(n mol/10億精子)をルシフェリン・ルシフェラーゼ法で測定してSV状態の確認を行ったところ、新鮮射出精子のATP量は130前後であったが、いずれの条件下でもSV処理後1時間以内に0近くまで激減していた。またSV処理開始直後には、いずれの条件下でもacrosomal exocytosis(以下aeと略記)を起こした精子はほとんどいなかったが、Ca^<2+>充足条件下では2時間のSV処理で約4割の精子がaeを起こし、供試卵子1個当たり平均4個以上の精子が卵子原形質膜と融合した。一方、精子内外のCa^<2+>を欠乏させた場合には、SV処理5時間後でもaeを起こした精子は1割前後と低く、卵子原形質膜と融合する精子もほとんどなかった。以上の実験結果から、SV法による先体反応誘起に精子内外のCa^<2+>が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。

The study representative examined the method of determining the existence of ATP in the condition of sperm metabolism substrate and acid deficiency, and the method of inducing precursor reaction. In this study, we investigated the mechanism of precursor anti-sperm induction by SV method, and the relationship between Ca^<2+> and sperm. 3 mature males were able to ejaculate fresh sperm, and Ca <2+> in and out of sperm was insufficient for 5 days.(Sperm metabolism substrate contains medium at a concentration of more than 1 billion/ml, suspended in a closed container at 40℃) After operation, the degree of precursor anti-induction is changed from white to white, and the staining method is used for transparent removal of eggs. The partner fusion test is used for adjustment during operation. Under sufficient Ca <2+> conditions, SV treatment was carried out in medium containing 2 mM CaCl2 and 1 mM EGTA, and NaCl/TES buffer was used. In the absence of sperm, BAPTA/AM is pre-loaded. The ATP content in sperm (n mol/billion sperm) was determined by the method of "Sv" status confirmation, and the ATP content of freshly ejaculated sperm was decreased within 1 time after SV treatment. After SV treatment started, sperm exocytosis(hereinafter abbreviated ae) started under the condition of Ca <2+> sufficiency. Under the condition of Ca <2+> sufficiency, SV treatment lasted for 2 days. About 4 sperm exocytosis started. One egg was tested. On average, more than 4 sperm eggs fused with protoplasm. In case of deficiency of Ca^<2+> in and out of sperm, SV treatment for 5 hours will cause sperm to rise before and after cutting, egg protoplasm will be fused. The above results show that the precursor anti-sperm induced Ca^<2+> in and out of sperm is important for the production of sperm.

项目成果

楠比呂志: "家畜精子の先体反応" 家畜人工受精. 177. 1-12 (1996)

Hiroshi Kusunoki：“牲畜精子的顶体反应”牲畜人工授精。 177. 1-12 (1996)