スターベーション法によるブタ精子の先体反応誘起機序の解明に関する研究

研究代表者が考案したスターベーション(以下SVと略記)法は、精子を代謝基質と酸素が不足する状態に置いてATPを枯渇させることで先体反応を誘起させる方法で、ヤギ、ウシ、ブタ、ヒトおよびグレビーシマウマで有効性を確認している。本研究では、SV法による先体反応誘起機序を解明する目的で、精子内外のCa^<2+>の関わりについてブタを材料として調べた。すなわち、妊孕能が明らかな3頭の成熟雄から得た新鮮射出精子を材料とし、精子内外のCa^<2+>が欠乏または充足する条件下で5時間までSV処理(精子を代謝基質を含まない媒液に10億/ml以上の濃度で浮遊して密閉容器内において40℃で加温)を行った後に、先体反応誘起の程度をトリパンブルー・ギムザ染色法と透明帯除去ブタ卵子を用いた配偶子融合試験により経時的に調べた。なお、Ca^<2+>充足条件下と外欠乏条件下でのSV処理では、媒液にそれぞれ2 mM CaCl2と1 mM EGTAを添加したNaCl/TES緩衝液を使用した。また内欠乏条件下では、SV処理に先だって精子にBAPTA/AMをpre-loadした。まず精子内ATP量(n mol/10億精子)をルシフェリン・ルシフェラーゼ法で測定してSV状態の確認を行ったところ、新鮮射出精子のATP量は130前後であったが、いずれの条件下でもSV処理後1時間以内に0近くまで激減していた。またSV処理開始直後には、いずれの条件下でもacrosomal exocytosis(以下aeと略記)を起こした精子はほとんどいなかったが、Ca^<2+>充足条件下では2時間のSV処理で約4割の精子がaeを起こし、供試卵子1個当たり平均4個以上の精子が卵子原形質膜と融合した。一方、精子内外のCa^<2+>を欠乏させた場合には、SV処理5時間後でもaeを起こした精子は1割前後と低く、卵子原形質膜と融合する精子もほとんどなかった。以上の実験結果から、SV法による先体反応誘起に精子内外のCa^<2+>が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。

研究代表者が考案したスターベーション(以下SVと略記)法は、精子を代謝基質と酸素が不足する状態に置いてATPを枯渇させることで先体反応を誘起させる方法で、ヤギ、ウシ、ブタ、ヒトおよびグレビーシマウマで有効性を確認している。本研究では、SV法による先体反応誘起機序を解明する目的で、精子内外のCa^<2+>の関わりについてブタを材料として調べた。すなわち、妊孕能が明らかな3頭の成熟雄から得た新鮮射出精子を材料とし、精子内外のCa^<2+>が欠乏または充足する条件下で5時間までSV処理(精子を代謝基質を含まない媒液に10億/ml以上の濃度で浮遊して密閉容器内において40℃で加温)を行った後に、先体反応誘起の程度をトリパンブルー・ギムザ染色法と透明帯除去ブタ卵子を用いた配偶子融合試験により経時的に調べた。なお、Ca^<2+>充足条件下と外欠乏条件下でのSV処理では、媒液にそれぞれ2 mM CaCl2と1 mM EGTAを添加したNaCl/TES緩衝液を使用した。また内欠乏条件下では、SV処理に先だって精子にBAPTA/AMをpre-loadした。まず精子内ATP量(n mol/10億精子)をルシフェリン・ルシフェラーゼ法で測定してSV状態の確認を行ったところ、新鮮射出精子のATP量は130前後であったが、いずれの条件下でもSV処理後1時間以内に0近くまで激減していた。またSV処理開始直後には、いずれの条件下でもacrosomal exocytosis(以下aeと略記)を起こした精子はほとんどいなかったが、Ca^<2+>充足条件下では2時間のSV処理で約4割の精子がaeを起こし、供試卵子1個当たり平均4個以上の精子が卵子原形質膜と融合した。一方、精子内外のCa^<2+>を欠乏させた場合には、SV処理5時間後でもaeを起こした精子は1割前後と低く、卵子原形質膜と融合する精子もほとんどなかった。以上の実験結果から、SV法による先体反応誘起に精子内外のCa^<2+>が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。