生細胞内で相分離する合成ペプチドの創製と機能開拓

本研究は，生細胞内で相分離する合成ペプチドを創製し，その機能を追求することにある．これまで，標的タンパク質を液滴から迅速に隔離・放出することを念頭に，2022年度は非天然の低分子リガンドに対する人工抗体（Monobody: 10 kDa）を用いたリガンドータンパク質ペアの開発に主に取り組んできた．誘導化が容易な1-(4-hydroxyphenyl)-3-phenylurea（HPPU）を人工リガンドとしたフィブロネクチン型人工抗体（抗HPPU人工抗体）の細胞内での評価に成功した．具体的には，HPPUに発蛍光性プローブであるMaP555を連結した誘導体を設計・合成し，細胞内タンパク質の蛍光標識実験を行った．加えて，HPPUとMaP555を連結するリンカーや親和性の異なるHPPU誘導体についても合成し，同様に評価を行った．まず，青色蛍光タンパク質と抗HPPU人工抗体を連結したヒストンタンパク質を細胞に発現させ，合成した発蛍光性プローブを添加した．無洗浄条件下において，発蛍光性プローブが抗HPPU人工抗体を認識し，核の染色を達成し，人工抗体の細胞内での蛍光標識のコントラストの向上にはリガンド結合部位近傍のトリプトファンの変異が重要であることを突き止めた．さらに，抗HPPU人工抗体への変異導入が発蛍光性や結合親和性に及ぼす影響についてin vitroで詳細に検討し，生細胞内においてタンパク質をコントラスト良く蛍光標識が可能な抗HPPU人工抗体の開発に成功した．最適化したHPPU人工抗体およびMaP555蛍光プローブを用いて，種々のオルガネラに局在するタンパク質の標識可能であった．また，STED顕微鏡を用いた微小管の超解像イメージングにも適用できることを示した．

本研究は，生細胞内で相分離する合成ペプチドを創製し，その機能を追求することにある．これまで，標的タンパク質を液滴から迅速に隔離・放出することを念頭に，2022年度は非天然の低分子リガンドに対する人工抗体（Monobody: 10 kDa）を用いたリガンドータンパク質ペアの開発に主に取り組んできた．誘導化が容易な1-(4-hydroxyphenyl)-3-phenylurea（HPPU）を人工リガンドとしたフィブロネクチン型人工抗体（抗HPPU人工抗体）の細胞内での評価に成功した．具体的には，HPPUに発蛍光性プローブであるMaP555を連結した誘導体を設計・合成し，細胞内タンパク質の蛍光標識実験を行った．加えて，HPPUとMaP555を連結するリンカーや親和性の異なるHPPU誘導体についても合成し，同様に評価を行った．まず，青色蛍光タンパク質と抗HPPU人工抗体を連結したヒストンタンパク質を細胞に発現させ，合成した発蛍光性プローブを添加した．無洗浄条件下において，発蛍光性プローブが抗HPPU人工抗体を認識し，核の染色を達成し，人工抗体の細胞内での蛍光標識のコントラストの向上にはリガンド結合部位近傍のトリプトファンの変異が重要であることを突き止めた．さらに，抗HPPU人工抗体への変異導入が発蛍光性や結合親和性に及ぼす影響についてin vitroで詳細に検討し，生細胞内においてタンパク質をコントラスト良く蛍光標識が可能な抗HPPU人工抗体の開発に成功した．最適化したHPPU人工抗体およびMaP555蛍光プローブを用いて，種々のオルガネラに局在するタンパク質の標識可能であった．また，STED顕微鏡を用いた微小管の超解像イメージングにも適用できることを示した．