微小液滴内反応を基盤とした高機能性組換え抗体ハイスループット単離法の開発

本年度は研究実施計画で策定した3 つのAim の中のAim1およびAim2を達成するため以下の準備を進めた。Aim3については後述の通り予備実験を進め、問題点の確認とその解決方法を考案した。（Aim1）　RNA免疫法による高機能性抗体産生の惹起を目指し、合成mRNAをデザインした。既報の論文を参考にHSD17B4の5'UTR-ターゲット遺伝子-PSMB3の3'UTRの後にhistone stem-loop poly(A)100を接続した構築を考案した。また、抗体作製ターゲット分子として、腫瘍内浸潤Treg細胞での特異的な発現が報告されているヒトCCR8を選定した。これらのRNAをin vitroで合成する際、RNA免疫においてその有効性が報告されているウラシルを1メチルシュードウリジンに置換し、また5'末端にキャップ構造を付加したものを合成した。これらの合成RNAがDNA免疫と比較して高効率な免疫反応の惹起が可能かを現在検討中である。（Aim2）　微小液滴（ドロップレット）を用いた高機能性抗体産生リンパ球の同定を目指し、マイクロ流体デバイス（On-Chip droplet generator）による細胞含有water-in-oil型微小液滴の作製を試みた。細胞にはテストケースとしてA431細胞およびEGFR細胞外ドメイン認識抗体産生ラットハイブリドーマ（株式会社細胞工学研究所より供与）を用いた。その結果、A431およびハイブリドーマを共に含む約100um経ドロップレットを作製することに成功した。その際、細胞培養培地中に蛍光標識二次抗体を加えることにより、抗体が反応したA431細胞を蛍光により可視することに成功した。

本年度は研究実施計画で策定した3 つのAim の中のAim1およびAim2を達成するため以下の準備を進めた。Aim3については後述の通り予備実験を進め、問題点の確認とその解決方法を考案した。（Aim1）　RNA免疫法による高機能性抗体産生の惹起を目指し、合成mRNAをデザインした。既報の論文を参考にHSD17B4の5'UTR-ターゲット遺伝子-PSMB3の3'UTRの後にhistone stem-loop poly(A)100を接続した構築を考案した。また、抗体作製ターゲット分子として、腫瘍内浸潤Treg細胞での特異的な発現が報告されているヒトCCR8を選定した。これらのRNAをin vitroで合成する際、RNA免疫においてその有効性が報告されているウラシルを1メチルシュードウリジンに置換し、また5'末端にキャップ構造を付加したものを合成した。これらの合成RNAがDNA免疫と比較して高効率な免疫反応の惹起が可能かを現在検討中である。（Aim2）　微小液滴（ドロップレット）を用いた高機能性抗体産生リンパ球の同定を目指し、マイクロ流体デバイス（On-Chip droplet generator）による細胞含有water-in-oil型微小液滴の作製を試みた。細胞にはテストケースとしてA431細胞およびEGFR細胞外ドメイン認識抗体産生ラットハイブリドーマ（株式会社細胞工学研究所より供与）を用いた。その結果、A431およびハイブリドーマを共に含む約100um経ドロップレットを作製することに成功した。その際、細胞培養培地中に蛍光標識二次抗体を加えることにより、抗体が反応したA431細胞を蛍光により可視することに成功した。