転移時のがんー間質相互作用を標識するin vivo ケミカルラベリング法の開発

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細胞間相互作用はがん転移に重要な役割を果たすが、一過性の細胞相互作用を高感度に検出するには技術開発が必要である。そこで本研究では、これまで細胞レベルでの分子間・細胞間ラベリング法として報告のあるEMARS(enzyme-mediated activation of radical source) 法、EXCELL(enzyme-mediated proximity cell labeling) 法をベースにin vivoでもラベル可能な高感度人工酵素を作製し、マウス肺転移モデルでのがん細胞－血管内皮細胞の相互作用を検出を目指す。まず、分子進化によるケミカルラベリング用人工酵素の改良を行うため、EMARS法およびEXCEL法をベースにHRP、SrtAにmutagenic PCRでランダム変異を加えたカセットを作製し、カセットのシーケンスにより変異の導入を確認した。この変異カセットを膜タンパク発現ベクターpDisplay骨格を用いて細胞膜上に発現するようにし、さらに遺伝子導入細胞の可視化並びに遺伝子導入効率の補正のためにT2A-tdTomato配列をpDisplay由来細胞質側配列の後に付加した。このキメラ遺伝子をレンチウイルスベクターに導入することで、細胞膜上に異なる変異が導入された人工酵素を発現するライブラリーベクターが完成した。人工酵素によるラベリング反応とtdTomatoによる遺伝子発現レベルの補正を用いたフローサイトメトリーによる高ラベリング能を持つ変異人工酵素発現細胞の濃縮を目指して、変異酵素ライブラリーを浮遊系293細胞にMOI = 0.3 で導入し、薬剤選択を行いライブラリー細胞を樹立した。