内在性受容体の特異的ｏｎ　ｃｅｌｌケミカルラベリングと時空間的機能解析

内源性受体的特异性细胞化学标记和时空功能分析

基本信息

批准号：
13J04988
负责人：
三木卓幸
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

Zn(II)に応答性を有するラベル化剤を開発し、Zn(II)条件的なproteomicsを考案し、実証した。Zn(II)イオンは細胞内外でシグナル伝達物質として働ことが示唆されており、動的に局在が変化する。Zn(II)シグナル伝達に関わる蛋白質を調べる手法は従来、総括的な解析ではなかった。申請者は、Zn(II)シグナル伝達に関わるタンパク質を総括的に調べる手法として、ケミカルラベル化を応用した新しい”conditional プロテオミクス”を開発した。これは、有機化学的手法によって、生細胞中の高濃度Zn(II)環境下に存在している蛋白質を選択的にラベル化する。ラベル化蛋白質を細胞破砕後に精製し、LC-MS/MS解析によって同定する方法である。まず、申請者はZn(II)との結合によって反応が活性化するラベル化剤”AIZin”を開発した。これは、蛋白質のラベル化に有用な求電子反応基Acyl Imidazole にdipicolylamine を連結した分子である。ルイス酸性の強いZn(II)の配位により、アシル転移反応の脱離基であるImidazoleの電子密度が低下することで、活性化し、蛋白質表面上の求核性アミノ酸残基と反応をする。C6細胞に対して一酸化窒素(NO)刺激を加えると、一時的に細胞内のZn(II)濃度が急激に上昇し、未知なvesicleに貯蔵される。AIZinラベル化剤をC6細胞に投与すると、NO刺激後に多数の蛋白質がラベル化された。ラベル化蛋白質を免疫沈降法によって精製し、トリプシンでpeptide断片化、LC-MS/MS解析を行った。その結果、未知なzinc-rich vesicleに存在する蛋白質を同定することができた。

开发了对锌（II）的响应的标记剂，并设计和证明了锌（II）条件蛋白质组学。已经提出锌离子在细胞内外充当信号传感器，它们的定位动态变化。以前，一种检查参与Zn（II）信号传导的蛋白质的方法不是全面的分析。申请人开发了一种新的“条件蛋白质组学”，该蛋白质组学将化学标记应用于一种全面检查涉及Zn（II）信号传导的蛋白质的方法。通过有机化学技术，这有选择地将活细胞中的Zn（II）环境高浓度标记。该方法涉及在细胞中断后纯化标记的蛋白质，并通过LC-MS/MS分析识别它。首先，申请人开发了标记剂“ Aizin”，该标记剂与Zn（II）结合时激活反应。这是将二吡咯胺与亲电基团酰基咪唑联系起来的分子，该酰基咪唑可用于标记蛋白质。路易斯酸性锌（II）的配位降低了咪唑的电子密度，咪唑的电子密度，酰基转移反应的离开组，并被激活并与蛋白质表面上的亲核氨基酸残基反应。对C6细胞的一氧化氮（NO）刺激暂时增加细胞中锌（II）的浓度，并存储在未知的囊泡中。在没有刺激后，给予AIZIN标记剂对C6细胞的施用导致了许多蛋白质的标记。通过免疫沉淀纯化了标记的蛋白质，然后用胰蛋白酶胡椒进行纯化，并进行了LC-MS/MS分析。结果，鉴定出富含锌的囊泡中存在的蛋白质。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

LDAI化学による内在性CAI2のmulti-color pulse chase imging

通过 LDAI 化学对内源性 CAI2 进行多色脉冲追踪成像

DOI：
发表时间：
2013
期刊：
影响因子：
0
作者：
三木卓幸;藤島祥平;浜地格
通讯作者：
浜地格

LDAI化学による内在性膜蛋白質のケミカルラベル化とpulse chase解析

使用 LDAI 化学和脉冲追踪分析对完整膜蛋白进行化学标记

DOI：
发表时间：
2013
期刊：
影响因子：
0
作者：
三木卓幸;藤島祥平;浜地格
通讯作者：
浜地格

LDAI化学による蛋白質ラベリング(1)膜蛋白質のpulse chase解析法への展開

使用LDAI化学进行蛋白质标记 (1) 膜蛋白脉冲追踪分析方法的开发

DOI：
发表时间：
2014
期刊：
影响因子：
0
作者：
三木卓幸;藤島祥平;浜地格
通讯作者：
浜地格

A novel conditional protein labeling method(1):Zinc ion responsive focused proteome analysis in live cell

一种新型条件蛋白质标记方法(1)：活细胞中锌离子响应聚焦蛋白质组分析

DOI：
发表时间：
2015
期刊：
影响因子：
0
作者：
三木　卓幸;阿波　諒;清中　茂樹;浜地　格
通讯作者：
浜地　格

Zn応答性ラベル化剤を用いたconditionalプロテオミクス

使用锌响应标记剂的条件蛋白质组学

DOI：
发表时间：
2015
期刊：
影响因子：
0
作者：
三木卓幸;阿波諒;清中茂樹;浜地格
通讯作者：
浜地格

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三木卓幸其他文献

細胞内で液-液相分離を作る設計ペプチドの開発

开发可在细胞内产生液-液相分离的工程肽

DOI：
发表时间：
2022
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作者：
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DOI：
发表时间：
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2022
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作者：
Miki Takayuki;Hashimoto Masahiro;Nakai Taichi;Mihara Hisakazu;三木卓幸;橋本　匡浩・三木卓幸・高橋　広樹・中山　彩恵・三原久和;Takayuki Miki;三木卓幸;三木卓幸・橋本　匡浩・中井　太一・梶原　圭悟・高橋　広樹・中山　彩恵・三原久和;三木卓幸・橋本　匡浩・高橋　広樹・中山　彩恵・三原久和;三木卓幸
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Design of self-assembling peptide tags for protein-based supramolecular construction in living cells

用于活细胞中基于蛋白质的超分子构建的自组装肽标签的设计

DOI：
发表时间：
2022
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作者：
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De novoペプチド間の自己集合と蛋白質間相互作用の協奏による細胞内での液滴形成

通过从头肽自组装和蛋白质-蛋白质相互作用形成细胞内液滴

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发表时间：
2022
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作者：
Miki Takayuki;Hashimoto Masahiro;Nakai Taichi;Mihara Hisakazu;三木卓幸;橋本　匡浩・三木卓幸・高橋　広樹・中山　彩恵・三原久和;Takayuki Miki;三木卓幸;三木卓幸・橋本　匡浩・中井　太一・梶原　圭悟・高橋　広樹・中山　彩恵・三原久和;三木卓幸・橋本　匡浩・高橋　広樹・中山　彩恵・三原久和;三木卓幸;Takayuki Miki・Masahiro Hashimoto・Hiroki Takahashi・Sae Nakayama・Hisakazu Mihara;Takayuki Miki;Takayuki Miki;中山　彩恵・三木卓幸・橋本　匡浩・高橋　広樹・梶原　圭悟・三原久和
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