内在性受容体の特異的ｏｎ　ｃｅｌｌケミカルラベリングと時空間的機能解析

Zn(II)に応答性を有するラベル化剤を開発し、Zn(II)条件的なproteomicsを考案し、実証した。Zn(II)イオンは細胞内外でシグナル伝達物質として働ことが示唆されており、動的に局在が変化する。Zn(II)シグナル伝達に関わる蛋白質を調べる手法は従来、総括的な解析ではなかった。申請者は、Zn(II)シグナル伝達に関わるタンパク質を総括的に調べる手法として、ケミカルラベル化を応用した新しい”conditional プロテオミクス”を開発した。これは、有機化学的手法によって、生細胞中の高濃度Zn(II)環境下に存在している蛋白質を選択的にラベル化する。ラベル化蛋白質を細胞破砕後に精製し、LC-MS/MS解析によって同定する方法である。まず、申請者はZn(II)との結合によって反応が活性化するラベル化剤”AIZin”を開発した。これは、蛋白質のラベル化に有用な求電子反応基Acyl Imidazole にdipicolylamine を連結した分子である。ルイス酸性の強いZn(II)の配位により、アシル転移反応の脱離基であるImidazoleの電子密度が低下することで、活性化し、蛋白質表面上の求核性アミノ酸残基と反応をする。C6細胞に対して一酸化窒素(NO)刺激を加えると、一時的に細胞内のZn(II)濃度が急激に上昇し、未知なvesicleに貯蔵される。AIZinラベル化剤をC6細胞に投与すると、NO刺激後に多数の蛋白質がラベル化された。ラベル化蛋白質を免疫沈降法によって精製し、トリプシンでpeptide断片化、LC-MS/MS解析を行った。その結果、未知なzinc-rich vesicleに存在する蛋白質を同定することができた。

Zn(II)に応答性を有するラベル化剤を開発し、Zn(II)条件的なproteomicsを考案し、実証した。Zn(II)イオンは細胞内外でシグナル伝達物質として働ことが示唆されており、動的に局在が変化する。Zn(II)シグナル伝達に関わる蛋白質を調べる手法は従来、総括的な解析ではなかった。申請者は、Zn(II)シグナル伝達に関わるタンパク質を総括的に調べる手法として、ケミカルラベル化を応用した新しい”conditional プロテオミクス”を開発した。これは、有機化学的手法によって、生細胞中の高濃度Zn(II)環境下に存在している蛋白質を選択的にラベル化する。ラベル化蛋白質を細胞破砕後に精製し、LC-MS/MS解析によって同定する方法である。まず、申請者はZn(II)との結合によって反応が活性化するラベル化剤”AIZin”を開発した。これは、蛋白質のラベル化に有用な求電子反応基Acyl Imidazole にdipicolylamine を連結した分子である。ルイス酸性の強いZn(II)の配位により、アシル転移反応の脱離基であるImidazoleの電子密度が低下することで、活性化し、蛋白質表面上の求核性アミノ酸残基と反応をする。C6細胞に対して一酸化窒素(NO)刺激を加えると、一時的に細胞内のZn(II)濃度が急激に上昇し、未知なvesicleに貯蔵される。AIZinラベル化剤をC6細胞に投与すると、NO刺激後に多数の蛋白質がラベル化された。ラベル化蛋白質を免疫沈降法によって精製し、トリプシンでpeptide断片化、LC-MS/MS解析を行った。その結果、未知なzinc-rich vesicleに存在する蛋白質を同定することができた。