化合物アレイ型プラットフォームを用いたP450分子群の基質特異性解析法の開発

使用复合阵列平台开发 P450 分子的底物特异性分析方法

• 批准号: 13J07508
• 负责人: 守谷 崇
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J07508/
• 关键词: シトクロムP450; ハイスループットスクリーニング; 基質特異性解析

本年度はこれまでに開発した2-アセチルベンゾフランを利用するシトクロムP450基質判別法(2-ABF法)と既存の基質結合スペクトル解析やLC/MS解析を組み合わせることで、迅速かつ網羅的なP450基質特異性解析システムの構築を検討した。具体的には、基質候補ライブラリーとして、当研究室所蔵の合成サンプルおよび試薬1053種類を用いて、巨大菌由来P450BM3および緑膿菌由来P450camの基質スクリーニングを検討した。まず、一次スクリーニングとして、これまでに開発した2-ABF法によりNAD(P)HからNAD(P)^+への変換を促進する小分子を検出した。次にヒットした化合物が基質として結合するかを確認するため、二次スクリーニングとして基質結合スペクトルの測定を行った。これらのスクリーニングにより絞り込まれた基質候補小分子に関しては、別途P450による酸化反応を行いLC/MSにより酸化生成物の解析を行った。連のスクリーニングの結果、P450により酸化される基質小分子を判別することに成功したが、自身は酸化されずにNAD(P)Hの消費のみを引き起こす偽陽性小分子が一次スクリーニングにおいて多数ヒットするということも分かった。偽陽性小分子がヒットした原因として、還元酵素系によるNAD(P)Hの消費を促進する小分子と、自身は酸化されずにNAD(P)Hの消費のみを促進するアンカップリング反応を誘起する小分子の存在が考えられた。このような偽陽性小分子を効率よく除くために、還元酵素系のみ存在する条件で小分子を反応させた際のNAD(P)^+の検出と、アンカップリング反応に伴い生成する過酸化水素の検出を組み合わせた結果、偽陽性の低減に成功した。このように、開発した2-ABF法と過酸化水素検出法を組み合わせることで、P450基質のみを判定できるハイスループットスクリーニングシステムのプロトタイプを構築することに成功した。

This year, we developed a 2-ABF method for the identification of P450 matrix, and a combination of existing matrix binding assays and LC/MS assays to rapidly identify and construct a P450 matrix specific assay system. The specific substrate candidate is selected from the group consisting of 1053 species of synthetic substrate prepared by the laboratory, P450BM3 species of Pseudomonas aeruginosa, and P450 cam substrate. The 2-ABF method is used to detect small molecules such as NAD(P)H, NAD (P)^+ and NAD (P)^+. Determination of matrix binding for secondary compounds The analysis of acidified products by LC/MS was carried out in the presence of P450. Even if the results of this study were negative, P450 was the most important factor in determining whether the substrate small molecule was acidified or not. False positive small molecules are responsible for the presence of small molecules that promote the consumption of NAD(P)H by reducing enzyme systems, and for the presence of small molecules that promote the consumption of NAD(P)H by themselves The false positive small molecule detection rate, the presence of the enzyme system, the detection of NAD(P)^+, the detection of N 2-ABF method and peracidified water element method were used to determine the composition of P450 matrix.

项目成果

cytochrome P450の基質スクリーニングを指向したNAD(P)^+選択的プローブの開発

开发用于细胞色素 P450 底物筛选的 NAD(P)^+ 选择性探针

• 发表时间: 2013
• 作者: 守谷崇;川又綾乃;高橋裕介;岩渕好治;叶直樹
• 通讯作者: 叶直樹

NAD^+選択的プローブを用いてチトクロムP450の基質を網羅的に検出する

使用 NAD^+ 选择性探针全面检测细胞色素 P450 底物

• 发表时间: 2013
• 作者: 守谷崇;川又綾乃;岩渕好治;叶直樹
• 通讯作者: 叶直樹

2,7-ナフチリジノン型蛍光色素の開発とシトクロムP450基質スクリーニングへの応用

2,7-萘啶酮型荧光染料的研制及其在细胞色素P450底物筛选中的应用

• 发表时间: 2013
• 作者: 守谷崇;川又綾乃;高橋裕介;岩渕好治;叶直樹
• 通讯作者: 叶直樹