ミスセンス変異体の安定性に注目したハイスループット機能評価系の開発

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GFP融合ランダム変異体のハイスループット表現型スクリーニング1．ポジティブコントロールを用いたフローサイトメトリーの条件検討野生型のGFP-STXBP1を発現する発現ベクターと顕著な不安定性を有するGFP-STXBP1-Y84D変異体を発現するベクターを用いて、フローサイトメトリーで分取可能か条件検討を行った。別々にトランスフェクションし、その細胞を混ぜてフローサイトメトリーを行ったところ、内部発現コントロールのDsRedが陽性で、GFPが陰性である細胞（Y84D群）を明瞭に分取可能であった。しかしながら、2つのプラスミドを同時にトランスフェクションした場合、同一細胞に同時にトランスフェクションされるため、内部発現コントロールのDsRedが陽性で、GFPが陰性である細胞（Y84D群）が認められないという結果が得られた。この結果から、トランスフェクションは各クローン別々に行う必要があると考えられた。スループットを上げるために、各クローンのミニプレップは96サンプル処理が可能なキットを用いて行い、各クローンのGFP-STXBP1の発現量を評価後に、抽出したDNAを混合して配列決定を行うこととした。その際には、計画したショートリードとロングリードシークエンスの利点を生かした変異体の配列決定が可能である。2．変異体発現ベクターライブラリの作製計画通り、Diversify PCRランダム突然変異誘発キット（タカラバイオ）を用いてランダム変異導入を行った。どの程度の変異が入るかの確認を含めて、まず20クローンを単離し、このクローンをトランスフェクションしてGFP蛍光で安定性が評価できることを確認した。