メダカ精原幹細胞の同定、単離、及び培養系の確立

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精原幹細胞のマーカーとしてRetが有力だったため， まず、A型精原細胞でRetを発現する細胞を同定した。この細胞が精原幹細胞であることを検証するため，精原幹細胞をBrdUで標識した。メダカ成体にBrdUを暴露し、一ヶ月後に精巣内におけるBrdU標識細胞を検出したところ、精巣壁近くに少数の精原幹細胞と思われる標識を確認できた。Ret発現A型精原細胞が精原幹細胞であることのより確実な検証法として、細胞移植実験の実施を計画した。移植実験の条件検討を行なうため、以下の実験を実施した。1）セルソーターで精原幹細胞を含むと考えられるＳＰ細胞分画を分取、2）この分画に含まれる細胞を蛍光色素PKH26で標識、標識細胞を他個体の精巣に移植。以上の実験の結果、標識細胞はホスト精巣内で精子形成を起こすことが判明した。本実験系を用いて、Ret発現A型精原細胞の移植実験を実施した。抗Ret抗体を用いてA型精原細胞のソーティングを試みたが，十分な量の細胞が得られなかったため、Retプロモーターで駆動する蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現するトランスジェニックメダカを作製を試みた。フォスミドベクターの作成に成功、このベクターを1細胞期のHdrRにインジェクションすることによって、トランスジェニックメダカを作製を試みた。しかしHdrRの生育が悪く、十分量のメダカを準備することが困難であった。精原幹細胞の培養系の確立については、メダカセルトリ細胞由来フィーダー細胞(Mtp1)のクローン化に成功し、様々な性質を持つ新たなフィーダー細胞株の作出に成功した。また，新たに培養系に添加するサイトカインとしてGDNFa，GDNFb，IL-11bをクローニングし、発現バキュロウイルスを作製した。機能的なリコンビナントタンパク質の精製が困難を極め、十分量のタンパク質を得ることができなかった。