メダカ精原幹細胞の同定、単離、及び培養系の確立

青鳉精原干细胞的鉴定、分离及培养体系的建立

• 批准号: 13J02845
• 负责人: 佐藤 竜一
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J02845/
• 关键词: 精原幹細胞; 精原細胞; LIF; IL-11ｂ; メダカ; 移植; Ret; ＬＩＦ; IL-11b; GDNF; 精子形成; 細胞移植; トランスジェニック; 精巣

精原幹細胞のマーカーとしてRetが有力だったため， まず、A型精原細胞でRetを発現する細胞を同定した。この細胞が精原幹細胞であることを検証するため，精原幹細胞をBrdUで標識した。メダカ成体にBrdUを暴露し、一ヶ月後に精巣内におけるBrdU標識細胞を検出したところ、精巣壁近くに少数の精原幹細胞と思われる標識を確認できた。Ret発現A型精原細胞が精原幹細胞であることのより確実な検証法として、細胞移植実験の実施を計画した。移植実験の条件検討を行なうため、以下の実験を実施した。1）セルソーターで精原幹細胞を含むと考えられるＳＰ細胞分画を分取、2）この分画に含まれる細胞を蛍光色素PKH26で標識、標識細胞を他個体の精巣に移植。以上の実験の結果、標識細胞はホスト精巣内で精子形成を起こすことが判明した。本実験系を用いて、Ret発現A型精原細胞の移植実験を実施した。抗Ret抗体を用いてA型精原細胞のソーティングを試みたが，十分な量の細胞が得られなかったため、Retプロモーターで駆動する蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現するトランスジェニックメダカを作製を試みた。フォスミドベクターの作成に成功、このベクターを1細胞期のHdrRにインジェクションすることによって、トランスジェニックメダカを作製を試みた。しかしHdrRの生育が悪く、十分量のメダカを準備することが困難であった。精原幹細胞の培養系の確立については、メダカセルトリ細胞由来フィーダー細胞(Mtp1)のクローン化に成功し、様々な性質を持つ新たなフィーダー細胞株の作出に成功した。また，新たに培養系に添加するサイトカインとしてGDNFa，GDNFb，IL-11bをクローニングし、発現バキュロウイルスを作製した。機能的なリコンビナントタンパク質の精製が困難を極め、十分量のタンパク質を得ることができなかった。

Spermatogonial stem cells are the same as type A spermatogonial cells Spermatogonial stem cells are identified by the following criteria: A few BrdU markers were identified in the sperm cells after one month of exposure. Ret found that type A spermatogonia and spermatogonia stem cells were identified and tested, and cell transplantation was carried out. The conditions for transplantation are discussed, and the following conditions are implemented. 1) Spermatogonial stem cells are separated from SP cells, 2) cells are separated from SP cells and labeled with PKH26, and cells are transplanted from other individuals. The above results indicate that sperm formation in the sperm cells is initiated. This paper describes the application of Ret in the transplantation of type A spermatogonia. Anti-Ret antibodies were used to test the expression of A-type spermatogonia in a large number of cells. The success of the project, the success of the project and the success of the project. It's hard to get pregnant. The establishment and characterization of spermatogenic stem cell culture lines were successfully investigated. The new culture system was developed by adding GDNFa, GDNFb, IL-11b to the culture medium. The function of the product is very difficult to refine, and the quality of the product is very difficult to obtain.

项目成果

Function of leukemia inhibitory factor (LIF) in spermatogenesis, revealed by using medaka spermatogonial culture system

利用青鳉精原细胞培养系统揭示白血病抑制因子（LIF）在精子发生中的功能

• 发表时间: 2014
• 作者: Takuto Ando;Ken Sawada;Kazuki Okano;Reishi Takashima;Hiroshi Nishi;大山修一・桐越仁美・原将也・近藤史;園田浩司;○Ryuichi Satoh Kazuki Takahashi Yamashita Masakane
• 通讯作者: ○Ryuichi Satoh Kazuki Takahashi Yamashita Masakane

ρ53ノックアウトメダカ精巣由来細胞株(Mtp1)の性質

ρ53 敲除青鳉睾丸来源细胞系 (Mtp1) 的特性

• 发表时间: 2013
• 作者: 廣澤幸一朗;吉田謙太;鈴木健一;藤原敬宏;Ankita Chadda;楠見明弘;S. Suzuki;佐藤 竜一
• 通讯作者: 佐藤 竜一

LIF (leukemia inhibitory factor) はメダカB型精原細胞の増殖を促進する

LIF（白血病抑制因子）促进青鳉B型精原细胞增殖

• 发表时间: 2014
• 作者: 安藤卓人;沢田健;高嶋礼詩;西弘嗣;○佐藤竜一 酒井則良 山下正兼
• 通讯作者: ○佐藤竜一 酒井則良 山下正兼