Mechanisms Of Er-To-Golgi Transport Of Lysosomal Enzymes

溶酶体酶从 Er 到高尔基体的转运机制

• 批准号: 10345430
• 负责人: Marco Sardiello
• 金额: $ 23.67万
• 依托单位: WASHINGTON UNIVERSITY
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2019-02-01 至 2023-01-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10345430
• 关键词: Mechanisms; Er; Golgi; Transport; Lysosomal

PROJECT SUMMARY/ABSTRACT    Lysosomes control a substantial part of cellular metabolism by acting as the main catabolic hub of the cell and  serving as a platform for the integration of numerous signals that modulate cell death, growth and proliferation.  Most lysosomal functions rely on a set of more than 50 acid hydrolases that degrade a wide variety of  macromolecules. Lysosomal enzymes are trafficked to the lysosome in two stages: transport of the newly  synthesized proteins from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi complex, and their subsequent  receptor-­assisted transfer from the Golgi to endolysosomal compartments. How lysosomal enzymes are  transported from the ER to the Golgi complex is unknown and, to our knowledge, the simple model of a bulk,  unregulated transportation has never been questioned. We have identified two candidate ER receptors, CLN6  and CLN8, whose deficiency results in altered maturation of lysosomal enzymes and lysosomal storage  disorder-­like diseases. We propose to study how CLN6 and CLN8 function in the pathway of maturation of  lysosomal enzymes. First, we will test the hypothesis that CLN6 and CLN8 directly interact with lysosomal  enzymes and that such interaction is disrupted by disease-­associated mutations on either CLN6/CLN8 or on  the surface of lysosomal enzymes (Aim 1). Second, we will examine the trafficking and maturation of newly  synthesized lysosomal enzymes to identify the exact step that is disrupted by CLN6 and CLN8 deficiency. We  will also define CLN6 and CLN8 functions in vivo by carrying out detailed tissue-­specific analyses of lysosomal  composition in CLN6-­ and CLN8-­deficient mouse lines by LC-­MS/MS-­based proteomics. To this aim, we have  generated a knock-­in Lamp1FLAG mouse line to efficiently isolate lysosomes from the desired tissues (Aim 2).  Third, we will identify the protein domains and motifs that are involved in CLN6/CLN8 interaction and that direct  their sorting across the compartments of the early secretory pathway via COP-­coated vesicles (Aim 3). We will  accomplish our goals with a multi-­disciplinary approach that uses the tools of biochemistry, molecular biology,  cell biology and mouse engineering and we will also develop a new method of in vivo lysosome isolation from  mouse tissues. Our results are likely to have important consequences for our understanding of the  mechanisms governing lysosomal biogenesis and of the molecular pathogenesis of numerous human  diseases. Some of the regulatory mechanisms we uncover may serve in the future as targets for modulating  lysosomal biogenesis in diseases resulting from impaired lysosomal function or in conditions, such as certain  types of cancer, that are characterized by aberrant or unrestricted lysosomal activation.

项目摘要/摘要    溶酶体通过充当细胞的主要分解代谢中心来控制细胞代谢的很大一部分，并且  作为整合调节细胞死亡、生长和增殖的众多信号的平台。  大多数溶酶体功能依赖于一组超过 50 种酸性水解酶，可降解多种物质  大分子。 溶酶体酶分两个阶段运输至溶酶体：运输新酶  从内质网（ER）合成蛋白质到高尔基复合体，以及它们的后续  受体辅助从高尔基体转移到内溶酶体室。 溶酶体酶是怎样的  从内质网运输到高尔基复合体是未知的，据我们所知，散装的简单模型，  不受管制的运输从未受到质疑。 我们已经确定了两个候选 ER 受体 CLN6  和 CLN8，其缺乏会导致溶酶体酶的成熟和溶酶体储存发生改变  类似疾病。 我们建议研究 CLN6 和 CLN8 如何在成熟途径中发挥作用  溶酶体酶。 首先，我们将测试 CLN6 和 CLN8 直接与溶酶体相互作用的假设  酶，并且这种相互作用会被 CLN6/CLN8 或 CLN6/CLN8 上的疾病相关突变所破坏  溶酶体酶的表面（目标 1）。 其次，我们将检查新的贩运和成熟度  合成溶酶体酶，以确定因 CLN6 和 CLN8 缺陷而中断的确切步骤。 我们  还将通过对溶酶体进行详细的组织特异性分析来定义 CLN6 和 CLN8 的体内功能  通过基于 LC-MS/MS 的蛋白质组学分析 CLN6 和 CLN8 缺陷小鼠系中的成分。 为了这个目标，我们有  生成了敲入 Lamp1FLAG 小鼠线，以有效地从所需组织中分离溶酶体（目标 2）。  第三，我们将确定参与 CLN6/CLN8 相互作用并指导的蛋白质结构域和基序  它们通过 COP 包被的囊泡在早期分泌途径的区室中进行分类（目标 3）。 我们将  通过使用生物化学、分子生物学等工具的多学科方法来实现我们的目标  细胞生物学和小鼠工程，我们还将开发一种从体内分离溶酶体的新方法  小鼠组织。 我们的结果可能会对我们理解这一现象产生重要影响  控制溶酶体生物发生的机制和许多人类的分子发病机制  疾病。 我们发现的一些监管机制可能在未来作为调节目标  因溶酶体功能受损或在某些条件下引起的疾病中的溶酶体生物发生  以异常或不受限制的溶酶体激活为特征的癌症类型。