Molecular imaging technologies for mechanobiology

项目摘要 细胞是高度动态的，挤压、拉扯和拉扯周围的环境和彼此。 每个 个体间的相互作用包含着力量。这些力量被特定的受体和分子感受到。虽然小 在量值（pN）上，这些分子力可以在细胞生命的许多方面产生深远的生物学影响 包括分化干细胞的命运、细胞分裂、癌症转移和血液凝固。因此 表征物理力和生化信号之间相互作用的能力是 了解生命系统中的信号通路。 有两种主要的技术用于研究分子 机械生物学：基于单分子力谱（SMFS）和牵引力显微镜（TFM）的 方法.虽然这些方法很强大，但它们有几个缺点。SMFS测量个体受体 力（pN），但它一次只对一个分子起作用。相反，TFM提供了细胞力的空间图， 但在nN尺度上，比单个细胞受体施加的力大几个数量级。 弥合 这些方法，我们发明了分子张力荧光显微镜（MTFM），它使用传统的 荧光显微镜通过使用校准的分子力探针以pN分辨率绘制细胞力。 该提案的目标是改变MTFM的功能，从而在以下方面实现数量级的改进： 空间和时间分辨率以及力方向的映射。分子机械生物学仍然是 在生物医学科学的边缘，因为缺乏工具来精确量化和联系力学， 细胞生物化学我们的目标是通过开发新的成像技术来改变分子机械生物学领域 技术，使研究细胞力在前所未有的分辨率。 这些技术，以 围绕基于DNA的MTFM探针，将提供一个广泛适用的技术平台， 分子力学，以及分子力在不同生物系统中的功能结果。 目标1 我们将解决空间分辨率的差距，并利用基于DNA的力探针来开发超分辨率 力敏涂料的目标是动态力成像与20纳米的空间分辨率。 在目标2中，我们将探索 力和力波动的动力学，利用两种方法的力量，FRAP和FCS，研究 具有纳秒至毫秒时间分辨率的分子力动力学。 最后，在目标3中，我们将利用荧光 偏振显微镜来测量分子力的3D取向。 我们将使用成纤维细胞病灶 粘附、血小板活化和凝血以及T细胞抗原识别来测试和验证我们的方法。 这些目标的实现将为理解分子力和产生分子动力学提供一个新的工具包。 力组织和动力学如何影响健康和疾病状态下的细胞功能的框架。

Project Summary    Cells  are  highly  dynamic,  squeezing,  pulling,  and  tugging  on  their  surroundings  and  on  each  other.  Each  individual interaction involves forces. These forces are felt by specific receptors and molecules. Although small  in magnitude (pN), these molecular forces can have profound biological impacts in many aspects of cellular life  including the fate of differentiating stem cells, cell division, cancer metastasis, and blood clotting. Therefore, the  ability  to  characterize  the  interplay  between  physical  forces  and  biochemical  signals  is a  critical  component  of  understanding  signaling  pathways  in  living  systems.  There  are  two  main  techniques  used  to  study  molecular  mechanobiology:  single  molecule  force  spectroscopy  (SMFS)  and  traction  force  microscopy  (TFM)  based  methods. While powerful, these approaches suffer from several drawbacks. SMFS measures individual receptor  forces (pN), but it does so only one molecule at a time. Conversely TFM provides spatial maps of cellular forces,  but on the nN scale, orders of magnitude larger than the forces applied by individual cell receptors.  To bridge  these  approaches,  we  invented  molecular  tension  fluorescence  microscopy  (MTFM)  which  uses  conventional  fluorescence microscopy to map cellular forces with pN resolution by using a calibrated molecular force probe.  The goal of this proposal is to transform the capabilities of MTFM allowing orders of magnitude improvement in  spatial and temporal resolution as well as the mapping of force orientation. Molecular mechanobiology remains  at  the  fringes  of  biomedical  sciences  because  of  the  lack  of  tools  to  precisely  quantify  and  link  mechanics  to  cellular biochemistry. Our goal is to transform the field of molecular mechanobiology by developing new imaging  technologies  to  enable  the  study  cellular  forces  at  unprecedented  resolution.  These  technologies,  centered  around  the  DNA-­based  MTFM  probes,  will  provide  a  broadly  applicable  platform  of  technology  to  investigate   molecular mechanics, and the functional outcomes of molecular forces, in diverse biological systems.  In Aim 1  we will address the spatial resolution gap, and leverage the DNA-­based force probes to develop super-­resolution  force-­PAINT  with  the  goal  of  dynamic  force  imaging  with  20  nm  spatial  resolution.  In  Aim  2  we  will  probe  the  dynamics of forces and force fluctuations by harnessing the power of two approaches, FRAP and FCS, to study  molecular  force  dynamics  with  nsec  to  msec  time  resolution.  Finally,  in  Aim  3  we  will  leverage  fluorescence  polarization  microscopy  to  measure  the  3D  orientations  of  molecular  forces.  We  will  use  fibroblast  focal  adhesions,  platelet  activation  and  coagulation,  and  T  cell  antigen  recognition  to  test  and  verify  our  approach.  Accomplishment of these goals will provide a new toolkit for understanding molecular forces and generating a  framework of how force organization and dynamics influence cellular function in healthy and disease states.