Molecular imaging technologies for mechanobiology

点击翻译按钮获取中文摘要

Project Summary    Cells  are  highly  dynamic,  squeezing,  pulling,  and  tugging  on  their  surroundings  and  on  each  other.  Each  individual interaction involves forces. These forces are felt by specific receptors and molecules. Although small  in magnitude (pN), these molecular forces can have profound biological impacts in many aspects of cellular life  including the fate of differentiating stem cells, cell division, cancer metastasis, and blood clotting. Therefore, the  ability  to  characterize  the  interplay  between  physical  forces  and  biochemical  signals  is a  critical  component  of  understanding  signaling  pathways  in  living  systems.  There  are  two  main  techniques  used  to  study  molecular  mechanobiology:  single  molecule  force  spectroscopy  (SMFS)  and  traction  force  microscopy  (TFM)  based  methods. While powerful, these approaches suffer from several drawbacks. SMFS measures individual receptor  forces (pN), but it does so only one molecule at a time. Conversely TFM provides spatial maps of cellular forces,  but on the nN scale, orders of magnitude larger than the forces applied by individual cell receptors.  To bridge  these  approaches,  we  invented  molecular  tension  fluorescence  microscopy  (MTFM)  which  uses  conventional  fluorescence microscopy to map cellular forces with pN resolution by using a calibrated molecular force probe.  The goal of this proposal is to transform the capabilities of MTFM allowing orders of magnitude improvement in  spatial and temporal resolution as well as the mapping of force orientation. Molecular mechanobiology remains  at  the  fringes  of  biomedical  sciences  because  of  the  lack  of  tools  to  precisely  quantify  and  link  mechanics  to  cellular biochemistry. Our goal is to transform the field of molecular mechanobiology by developing new imaging  technologies  to  enable  the  study  cellular  forces  at  unprecedented  resolution.  These  technologies,  centered  around  the  DNA-­based  MTFM  probes,  will  provide  a  broadly  applicable  platform  of  technology  to  investigate   molecular mechanics, and the functional outcomes of molecular forces, in diverse biological systems.  In Aim 1  we will address the spatial resolution gap, and leverage the DNA-­based force probes to develop super-­resolution  force-­PAINT  with  the  goal  of  dynamic  force  imaging  with  20  nm  spatial  resolution.  In  Aim  2  we  will  probe  the  dynamics of forces and force fluctuations by harnessing the power of two approaches, FRAP and FCS, to study  molecular  force  dynamics  with  nsec  to  msec  time  resolution.  Finally,  in  Aim  3  we  will  leverage  fluorescence  polarization  microscopy  to  measure  the  3D  orientations  of  molecular  forces.  We  will  use  fibroblast  focal  adhesions,  platelet  activation  and  coagulation,  and  T  cell  antigen  recognition  to  test  and  verify  our  approach.  Accomplishment of these goals will provide a new toolkit for understanding molecular forces and generating a  framework of how force organization and dynamics influence cellular function in healthy and disease states.