The immunomodulatory role of Ankyrin repeat containing effectors expressed by Coxiella burnetii

点击翻译按钮获取中文摘要

C.  burnetii  causes  the  zoonotic  disease  Q  fever  and  resides  within  monocytes/macrophages  manipulating  innate  immune  response.  C.  burnetii  requires  de  novo  protein  synthesis  and  a  functional  Type  IVB  Secretion  System  (T4BSS)  to  modulate  host  the  eukaryotic  transcription  factor  Nuclear  Factor-­κB  (NF-­κB)  signaling  an  essential  regulator  of  innate  response.  Multiple  pathogens including C. burnetii deliver eukaryotic-­type Ank-­containing effectors to hijack NF-­κB  signaling. C. burnetii Nine Mile isolate encodes 5 Ank-­containing effectors (AnkA, -­C, -­F, -­G, and  -­K). Experiments found that 1) AnkK and AnkC significantly contributes to C. burnetii’s ability to  inhibit  NF-­κB  dependent  gene  expression  and  2)  ectopic  expression  of  AnkK  or  AnkC  in  HEK293/hTLR4-­MD2-­CD14 cells blocks accumulation of NF-­κB in the nucleus. The central focus  of  this  proposal  is  to  determine  mechanistically  how  the  C.  burnetii  effectors,  AnkK  and  AnkC,  modulate  NF-­κB  to  promote  intracellular  survival  and  replication.  The  central  hypothesis  by  accomplishing the following specific aims: 1. Determine the contribution of AnkK and -­C to  C.  burnetii’s  virulence.  The  working  hypothesis  is  that  C.  burnetii  AnkK  and  AnkC  promotes  pathogen  virulence  by  modulating  NF-­κB  activation.    To  test  this,  we  will  generate  complementation  strains  of  C.  burnetii  NM  II  (NM  II)  ankK::Tn  and  ankC::Tn  mutants  and  investigate  in  vitro  growth  rescue  and  p65  nuclear  translocation  for  phenotype  rescue  in  tissue  culture cells. To investigate in vivo growth rescue, we will employ the SCID mice/NM II infection  model.  Employing  CYA-­translocation  assays,  we  will  then  test  Type  4  secretion  system  requirement. Furthermore, we will generate ΔdotA, ΔAnkK, and ΔAnkC gene knockouts and their  complementation strains in virulent C. burnetii NM I (NM I) to infect C57Bl/6N mice and determine  the  relative  contribution  of  AnkK  and  AnkC  to  bacterial  virulence  in  vivo.  2.  Determine  the  mechanism  of  AnkK/AnkC-­dependent  NF-­κB  inhibition  during  C.  burnetii  infection.  The  working hypothesis is C. burnetii AnkK or AnkC interacts with host targets in the canonical NF-­κB  pathway  or  potentially  sequesters  p65  to  block  its  nuclear  translocation.  We  will  deplete  p65  in  host cells to investigate growth rescue of NM II ankK::Tn and ankC::Tn mutants. We will examine  expression,  phosphorylation  and  degradation  status  of  individual  components  of  the  canonical  NF-­κB pathway in stable THP-­1 cell lines expressing eGFP-­tagged AnkK and AnkC. To identify  host-­binding  partner(s),  pull  down  assays  (GFP-­trap)  will  be  performed  with  THP-­1  stable  cells  expressing eGFP-­AnkK and –AnkC. To determine C. burnetii AnkK or AnkC driven modulation of  host p65-­dependent gene expression in infected cells, we will perform scRNA-­seq and p65/ChIP-­ seq experiments.