The immunomodulatory role of Ankyrin repeat containing effectors expressed by Coxiella burnetii

伯氏柯克斯体表达的含有锚蛋白重复序列​​的效应子的免疫调节作用

• 批准号: 9815034
• 负责人: JAMES Evans SAMUEL
• 金额: $ 22.44万
• 依托单位: TEXAS A&M UNIVERSITY HEALTH SCIENCE CTR
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2019-06-20 至 2021-05-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/9815034
• 关键词: Agonist; Amino Acids; Ankyrin Repeat; Attenuated; Bacteria; Binding; Biological Assay; Bone Marrow; C57BL/6 Mouse; C57BL/6N Mouse; CD14 gene; Cell Line; Cell Nucleus; Cells; ChIP-seq; Complement; Coxiella burnetii; Data; Disease; Ectopic Expression; Epitopes; Gene Expression; Genetic; Genetic Transcription; Goals; Growth; Hela Cells; Immune Evasion; Impairment; In Vitro; Individual; Infection; Inflammatory Response; Inhalation; Innate Immune Response; Kinetics; Lead; Maps; Mediating; Modeling; Molecular; Nuclear; Nuclear Translocation; Pathogenicity; Pathway interactions; Phenotype; Phosphorylation; Process; Protein Biosynthesis; Proteins; Publishing; Q Fever; RNA Interference; Role; SCID Mice; Signal Pathway; Signal Transduction; System; TNF gene; Testing; Virulence; Virulence Factors; Virulent; Zoonoses; base; experimental study; genetic predictors; immunoregulation; in vivo; inhibitor/antagonist; knock-down; knockout gene; macrophage; monocyte; mutant; p65; pathogen; pathogenic bacteria; response; single-cell RNA sequencing; tissue/cell culture; tool; transcription factor

C.  burnetii  causes  the  zoonotic  disease  Q  fever  and  resides  within  monocytes/macrophages  manipulating  innate  immune  response.  C.  burnetii  requires  de  novo  protein  synthesis  and  a  functional  Type  IVB  Secretion  System  (T4BSS)  to  modulate  host  the  eukaryotic  transcription  factor  Nuclear  Factor-­κB  (NF-­κB)  signaling  an  essential  regulator  of  innate  response.  Multiple  pathogens including C. burnetii deliver eukaryotic-­type Ank-­containing effectors to hijack NF-­κB  signaling. C. burnetii Nine Mile isolate encodes 5 Ank-­containing effectors (AnkA, -­C, -­F, -­G, and  -­K). Experiments found that 1) AnkK and AnkC significantly contributes to C. burnetii’s ability to  inhibit  NF-­κB  dependent  gene  expression  and  2)  ectopic  expression  of  AnkK  or  AnkC  in  HEK293/hTLR4-­MD2-­CD14 cells blocks accumulation of NF-­κB in the nucleus. The central focus  of  this  proposal  is  to  determine  mechanistically  how  the  C.  burnetii  effectors,  AnkK  and  AnkC,  modulate  NF-­κB  to  promote  intracellular  survival  and  replication.  The  central  hypothesis  by  accomplishing the following specific aims: 1. Determine the contribution of AnkK and -­C to  C.  burnetii’s  virulence.  The  working  hypothesis  is  that  C.  burnetii  AnkK  and  AnkC  promotes  pathogen  virulence  by  modulating  NF-­κB  activation.    To  test  this,  we  will  generate  complementation  strains  of  C.  burnetii  NM  II  (NM  II)  ankK::Tn  and  ankC::Tn  mutants  and  investigate  in  vitro  growth  rescue  and  p65  nuclear  translocation  for  phenotype  rescue  in  tissue  culture cells. To investigate in vivo growth rescue, we will employ the SCID mice/NM II infection  model.  Employing  CYA-­translocation  assays,  we  will  then  test  Type  4  secretion  system  requirement. Furthermore, we will generate ΔdotA, ΔAnkK, and ΔAnkC gene knockouts and their  complementation strains in virulent C. burnetii NM I (NM I) to infect C57Bl/6N mice and determine  the  relative  contribution  of  AnkK  and  AnkC  to  bacterial  virulence  in  vivo.  2.  Determine  the  mechanism  of  AnkK/AnkC-­dependent  NF-­κB  inhibition  during  C.  burnetii  infection.  The  working hypothesis is C. burnetii AnkK or AnkC interacts with host targets in the canonical NF-­κB  pathway  or  potentially  sequesters  p65  to  block  its  nuclear  translocation.  We  will  deplete  p65  in  host cells to investigate growth rescue of NM II ankK::Tn and ankC::Tn mutants. We will examine  expression,  phosphorylation  and  degradation  status  of  individual  components  of  the  canonical  NF-­κB pathway in stable THP-­1 cell lines expressing eGFP-­tagged AnkK and AnkC. To identify  host-­binding  partner(s),  pull  down  assays  (GFP-­trap)  will  be  performed  with  THP-­1  stable  cells  expressing eGFP-­AnkK and –AnkC. To determine C. burnetii AnkK or AnkC driven modulation of  host p65-­dependent gene expression in infected cells, we will perform scRNA-­seq and p65/ChIP-­ seq experiments.

贝氏梭菌引起人畜共患病Q热，并存在于单核细胞/巨噬细胞内 操纵先天性免疫反应。贝氏梭菌需要从头蛋白质合成和 调节宿主真核转录的功能性IVB型分泌系统（T4 BSS 因子核因子-κB B（NF-κ B B）信号传导是先天反应的基本调节因子。 包括贝氏梭菌在内的病原体递送含有效应子的真核生物型Ank-κB以劫持NF-κB B 贝氏梭菌Nine Mile分离株编码5种含有Ank-A的效应子（AnkA、-AnkC、-AnkF、-AnkG和-AnkB）。 实验发现1）AnkK和AnkC显著有助于贝氏隐孢子虫的能力， 抑制NF-κB B依赖性基因表达和2）AnkK或AnkC的异位表达 HEK 293/hTLR 4-CD 4 MD 2-CD 14细胞阻断NF-κB B在细胞核中的积累。 该建议的目的是确定伯氏隐孢子虫效应子AnkK和AnkC， 调节NF-κB B以促进细胞内存活和复制。 实现以下具体目标：1.确定AnkK和-BTC对 工作假设是贝氏梭菌AnkK和AnkC促进了贝氏梭菌的毒力。 通过调节NF-κ B B的活化来调节病原体的毒力。 为了测试这一点，我们将生成 贝氏梭菌NM II（NM II）ankK：：Tn和ankC：：Tn突变体的互补菌株，和 研究体外生长拯救和p65核转位用于组织中表型拯救 为了研究体内生长拯救，我们将采用SCID小鼠/NM II感染 然后，我们将采用CYA-CYB易位测定来测试4型分泌系统， 要求。此外，我们将产生ΔdotA、ΔAnkK和ΔAnkC基因敲除及其 在毒性贝氏梭菌NM I（NM I）中的互补菌株感染C57 B1/6 N小鼠，并确定 测定AnkK和AnkC对细菌体内毒力的相对贡献。 在贝氏隐孢子虫感染过程中，AnkK/AnkC-B依赖的NF-κB B抑制机制。 工作假设是贝氏梭菌AnkK或AnkC与典型NF-κB B中的宿主靶点相互作用 p65的核转位。我们将耗尽p65， 宿主细胞研究NM II ankK：：Tn和ankC：：Tn突变体的生长拯救。 表达，磷酸化和降解状态的个别组成部分的典型的 NF-κ B B通路在稳定表达eGFP-κ B标记的AnkK和AnkC的THP-κ B1细胞系中的表达。 宿主-GFP结合配偶体，将用THP-GFP 1稳定细胞进行下拉测定（GFP-GFP陷阱 为了确定贝氏隐孢子虫AnkK或AnkC驱动的eGFP-AnkK和eGFP-AnkC的调节， 在感染细胞中宿主p65依赖性基因的表达，我们将进行scRNA-PCR和p65/ChIP-PCR。 seq实验。