Microbially generated protons mediate interkingdom host-microbiome cross-talk and maintain intestinal homeostasis via reciprocal functions of two proton-sensing GPCRs

项目概述：在炎症性肠病（IBD）、肠 感染，以及手术创伤和环境损伤。组织修复是一个复杂的过程， 协调细胞过程以修复肠粘膜。 我们最近报道说， 微环境特异性地富集了粘膜-上皮相关的微生物群落，其增强了上皮 伤口愈合下一代基因测序的进展已经确定了不同的微生物物种， 宿主中的宏基因组;然而，要了解和利用微生物群中超过800万个基因的潜力， 及其代谢功能，应用质谱-质谱法鉴定小分子代谢物， 通过细胞生物学方法进行功能表征至关重要。 因此，这项拟议的研究将奠定 这是我在代谢组学和肠道屏障功能细胞生物学方面接受严格训练的基础。为此，我们 通过质谱法进行了初步分析-基于质谱的完整和损伤的整体代谢组学分析 粘膜以及无菌小鼠和常规小鼠的结肠。 我们发现了一种微生物 具有低pKa的代谢物，其在结肠隐窝中建立细胞外pH梯度是必需的， 而在无菌小鼠中则不然。我们还发现，结肠上皮细胞的传统， 小鼠表达增加水平的质子传递敏感GPCR（GPCR 4和GPCR 68）。根据初步调查结果， 该项目的工作假设是：1）损伤的粘膜组织及其相关的微生物群产生 代谢物来调节结肠质子浓度的时空变化，从而调节 肠道内稳态和修复，2）微生物群产生的代谢产物调节质子浓度， 由肠细胞的质子-质子敏感GPCR感知以调节肠道通透性。目标1：确认角色 微生物群产生的代谢产物在调节细胞增殖和修复中的作用， GPCR 68在GPCR 4-β/-β小鼠和GPCR 68-β/-β小鼠中的表达，其集落在我们的动物设施中建立。我们还将 对GPCR 4-β/β小鼠和GPCR 68-β/β小鼠的结肠进行代谢组学分析和RNA-测序分析。 此外，我们将确定无菌小鼠中受损粘膜的代谢组。具体目标2 将决定质子梯度的功能以及特定代谢物在肠道调节中的作用 紧密连接的渗透性。 埃默里大学拥有丰富的学术研究环境， 资源将用于开展拟议的研究，以及质谱中心位于 位于亚特兰大市格鲁吉亚理工学院的小镇。拟议的研究与结构化的 导师、顾问和合作者团队以及包括教学课程和 研讨会，旨在促进我的长期目标，发展一个独立的非营利组织资助的研究计划 慢性胃肠炎性疾病，如IBD，符合NIDDK的使命。

Project  Summary:  Intestinal  damage  is  observed  in  inflammatory  bowel  disease  (IBD),  enteric  infections, as well as following surgical trauma, and environmental insults. Tissue restitution is a complex but  coordinated  cellular  process  to  repair  gut  mucosa.  We  recently  reported  that  the  intestinal  wound  microenvironment  specifically  enriches  a  mucosa-­associated  microbial  consortium,  which  enhanced  epithelial  wound healing. The advances in next generation gene sequencing have identified diverse microbial species and  metagenomes in the host;; however, to understand and exploit the potential of the microbiota’s >8 million genes  and their metabolic functions, application of the mass-­spectrometry-­based identification of small metabolites and  functional  characterization  by  the  methods  of  cell  biology  are  crucial.  Hence  this  proposed  study  will  lay  a  foundation for my rigorous training in metabolome and cell biology of gut barrier function. For this purpose, we  performed a preliminary analysis by mass spectrometry-­based global metabolomic profiling of intact and injured  mucosa  as  well  as  colon  of  germ-­free  and  conventional  mice.  We  found  an  elevated  synthesis  of  microbial  metabolites with low pKa, which are essential in establishing an extracellular pH gradient in the colonic crypts of  the conventional mice, but not in germfree mice. We also found that the colonic epithelial cells of conventional  mice express increased levels of proton-­sensing GPCRs (GPCR4 and GPCR68). Based on preliminary findings,  the working hypotheses of this project are: 1) the injured mucosal tissue and its associated microbiota produce  metabolites to regulate spatiotemporal changes in the proton concentration of the colon and thereby regulate  intestinal homeostasis and repair, 2) microbiota-­produced metabolites modulate proton concentration, which is  perceived by the proton-­sensing GPCRs of enterocytes to regulate gut permeability. Aim 1 is to confirm the role  of microbiota-­produced metabolites in regulating cellular proliferation & repair via proton-­sensing GPCR4 and  GPCR68 in the GPCR4-­/-­ and GPCR68-­/-­ mice, whose colonies are established in our animal facility. We will also  perform  the  metabolomic  profiling  and  RNA-­seq  analysis  of  the  colon  of  GPCR4-­/-­  and  GPCR68-­/-­  mice.  Furthermore, we will determine the metabolome of the injured mucosa in the germ-­free mouse. Specific Aim 2  will determine the function of the proton gradient & also the role of specific metabolites in the regulation of gut  permeability  by  tight-­junction.  Emory  University  boasts  an  intellectually  rich  research  environment  whose  resources will be used to carry out the proposed research as well as the mas-­spectrometry center located across  the town in Georgia Institute of Technology, Atlanta. The proposed research, in combination with a structured  team  of  mentor,  advisors,  and  collaborators  as  well  as  the  training  plan  that  includes  didactic  courses  and  workshops, is designed to facilitate my long-­term goal of developing an independently-­funded research program  in chronic gastrointestinal inflammatory diseases, such as IBD, consistent with the mission of the NIDDK.