STRUCTURAL DETERMINATION OF PARAMAGNETIC CENTER IN PUTIDAREDOXIN

腐胺氧还蛋白顺磁中心的结构测定

基本信息

  • 批准号:
    6118646
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 2.03万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    1999
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    1999-05-15 至 2000-04-30
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

Structural determination of paramagnetic proteins by solid state and solution NMR techniques is limited by severe line broadening due to the strong hyperfine interaction between the nuclei and the paramagnetic center. This prevents the use of standard NMR structural methods within a few angstroms of the metal center. In this context, high frequency (140 GHz) pulsed ENDOR techniques are ideally suited to extract hyperfine interactions in the vicinity of the paramagnetic center. We have been investigating a 2-Fe 2-S ferredoxin putidaredoxin (Pdx), where the metal center displays an effective spin S = 1/2 in the reduced form (Fe" - Fe") and the cluster is ligated by four cysteinyl sulfurs. We were able to record 140 GHz spin-echo detected spectra at low temperatures (10 K) with excellent signal-to-noise (> 50) and determine the g-anisotropy to g,, = 2.02 and g_L = 1.94. TI-relaxation of the Fe-cluster was measured between 9 and 40 K. We found short T,- values of 50 gs at 9 K and a more complex biexponential behavior between 15 - 40 K, likely due to the thermal population of higher excited spin states. A special ENDOR resonator for efficient irradiation of low-gamma nuclei was developed and preliminary "C-Mims-ENDOR spectra were recorded at 10 K. In contrast to ENDOR data previously reported in the literature at low EPR frequencies (35 GHz), the ' 3C larmor frequency at 5 Tesla (53 MHz) is well separated from other nuclei and we observe symmetric ENDOR lineshapes around the larmor frequency. In a "C uniformly labeled protein, two distinct hyperfine splitting have been observed, which we attribute to the cystein methylene groups. Further experiments with selectively labeled proteins are in progress and will permit unambiguous assignments of the observed hyperfine couplings.
固相法测定顺磁性蛋白质的结构 和溶液NMR技术受到严重的谱线展宽的限制, 原子核和原子核之间的强超精细相互作用 顺磁中心 这阻止了标准NMR结构的使用。 方法在金属中心的几埃内。 在这一背景下, 高频(140 GHz)脉冲ENDOR技术非常适合于 在顺磁层附近提取超精细相互作用 中心 我们一直在研究一种2-Fe 2-S铁氧还蛋白 putidaredoxin(Pdx),其中金属中心显示有效自旋 S = 1/2,以还原形式(Fe”- Fe”),并且簇通过 四个半胱氨酰硫。 我们能够记录到140 GHz的自旋回波 在低温(10 K)下检测到的光谱, 信噪比(> 50),并确定g-各向异性为g,i = 2.02 g_L = 1.94。 铁团簇的TI-弛豫测量在 9和40 K。我们发现,在9 K和更高温度下, 15 - 40 K之间的复杂双指数行为,可能是由于 更高激发自旋态的热布居。 一个特殊的ENDOR 研制了一种用于低γ核辐照的谐振腔 并在10 K下记录初步的“C-Mims-ENDOR”光谱。在 与文献中先前报道的ENDOR数据相比, EPR频率(35 GHz),在5特斯拉(53 MHz)与其他核分离良好,我们观察到对称的 ENDOR在拉莫尔频率附近的线形。 在“C”中, 标记的蛋白质,已经观察到两种不同的超精细分裂, 我们将其归因于半胱氨酸亚甲基。 进一步 选择性标记蛋白质的实验正在进行中, 允许所观察到的超精细耦合的明确分配。

项目成果

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