Cell-Specific Visualization of Endogenous Proteins

点击翻译按钮获取中文摘要

PROJECT SUMMARY  A major goal of the BRAIN initiative is to understand neuronal connectivity and plasticity in the context of  animal behavior. The functions and connectivity of neurons are established and manifested by their constituent  proteins. Monitoring the organization of individual proteins in specific neuronal subtypes in behaving animals  may therefore provide an important readout of cellular and circuit properties underlying animal behavior.  However, it remains challenging to visualize endogenous synaptic protein organization in individual neurons in  living animals. Most studies rely on the overexpression of fluorescently tagged proteins of interest. Protein  overexpression can alter protein stoichiometry, trafficking, subcellular localization, and cell signaling, ultimately  affecting cellular and circuit functions. Although ‘knock-­in’ strategies can in principle bypass problems  associated with protein overexpression, they result in global expression of the labeled protein, leading to high  fluorescence background and a lack of cell-­specific contrast. Other alternative labeling methods for visualizing  endogenous proteins, such as the intracellular expression of fluorescently tagged intrabodies and CRISPR-­ mediated gene editing, also have their own limitations, including potential off-­target effects.   To solve the above problems, we recently developed a novel genetic strategy called endogenous labeling via  exon duplication (ENABLED). We have used this method to label the critical postsynaptic marker protein PSD-­ 95 with the yellow fluorescent protein mVenus in all neurons, in a sparse subset of neurons, or in specific  neuronal subtypes. Unlike the conventional approach to visualizing PSD-­95 via overexpression, our strategy  does not result in altered neuronal functions, and, for the first time, allows for the monitoring of PSD-­95 at  endogenous levels in individual neurons in living mice. Despite these advantages, the ENABLED strategy can  be further optimized to broaden its applicability and to enhance its sensitivity. Furthermore, to comprehensively  examine neuronal functions and connectivity, additional synaptic proteins will need to be labeled at both the  presynaptic and postsynaptic sides. Here, we request funds to optimize the ENABLED strategy and use it to  label 12 additional critical synaptic proteins in mice. We will also generate ENABLED mice in which the  synaptic proteins can be labeled using different colors for simultaneous imaging. The reagents we generate will  be made available to the neuroscience community to provide researchers with an unprecedented ability to  monitor synaptic connectivity and plasticity under physiological conditions in behaving animals.