Inhibition of DNA double strand break repair in TNBC by nitro-fatty acids

DNA双链断裂（DSB）是最致命的DNA损伤类型。 DSB修复缺陷 同源重组介导的（HDR）DNA修复使癌细胞对聚（ADP核糖）抑制剂敏感 聚合酶（PARP），一种促进单链碱基修复（SSB）的酶。转移性三阴性乳腺癌 在HDR基因BRCA 1和BRCA 2中携带HDR-A失活生殖系突变的TNBC癌症患者 （gBRCAm），PARP抑制剂（PARPi）奥拉匹布的EMBRACA试验已经显示出延长寿命的作用。因此，在本发明中， 奥拉匹布现在是FDA批准的用于gBRCAm TNBC患者的单一疗法。 这些发现高度 意义重大，因为他们赞同HDR中的遗传缺陷为PARPi杀死癌细胞铺平了道路的概念 阻止单链DNA修复在所有TNBC患者中，只有15%是gBRCAm携带者， 85%的gBRCAm-β阴性TNBC显示对PARPi的应答不一致，尽管存在BRCAm-β样表型 （BRCAness）。这意味着本文提出的研究计划，因为它提出通过以下方式诱导HDR-1缺陷： Rad 51抑制，然后反过来放大PARPi功效。我们已经鉴定了一类新的HDR抑制剂， 即脂肪酸（NFA）硝基烯烃，其在人体中耐受良好且易于使用。我们的研究 已经确定了一个独特的调控结构域的基本HDR基因Rad 51，这是控制减少-β-D-半乳糖苷酶 氧化（氧化还原）翻译后修饰（PTM），并可以很容易地作为一种新的靶向 TNBC的化疗策略。 通过一种可逆的和位点特异性的烷基化酶介导的Rad 51的PTM 脂质亲电体硝基脂肪酸（NFA）严重损害核Rad 51病灶和TNBC细胞存活， 特别是当在体外和体内与PARPis组合时。 因此，具体重点放在两个不同的 视角 首先，详细的机制理解将来自于描述Rad 51的特异性 NFA的烷基化作用以及对HDR的影响。此外，从X-溴代物设计了一种有效的NFA区域异构体， 基于射线结构的建模研究已经显示了TNBC细胞杀伤的增加，将进一步评估 对于Rad 51靶向的程度、HDR修复的抑制与PARPi的组合以及对TNBC的净效应， 在TNBC细胞系组中的杀伤。由于NFA具有加合蛋白质Cys残基的能力， 也支持NFA-β介导的另一种DNA DSB修复途径的抑制，已知在 Rad 51抑制，DNA DSB修复中其他可能的NFA蛋白靶点，将通过点击化学进行检查 基于HPLC-MS/MS的NFA靶蛋白质组学分析。 第二，TNBC患者-乳腺癌来源的异种移植乳房 癌症模型与基因工程TNBC小鼠模型的组合，将促进更多的临床 NFA与PARPi组合的体外和体内相关作用。研究计划将揭示一种新药 TNBC治疗的策略，其中NFA对Rad 51-β介导的DNA修复的抑制使TNBC细胞 对PARP抑制更敏感，从而增加TNBC细胞杀伤。

DNA  double  strand  breaks  (DSBs)  are  the  most  lethal  type  of  DNA  damage.  Defects  in  DSB  repair  by  homologous recombination-­directed (HDR) DNA repair sensitizes cancer cells to inhibitors of poly (ADP ribose)  polymerase (PARP), an enzyme facilitating single strand base repair (SSB). In metastatic triple negative breast  cancer  (TNBC)  patients  carrying  HDR-­inactivating  germline  mutations  in  the  HDR  genes  BRCA1  and  BRCA2  (gBRCAm), the EMBRACA trial of the PARP inhibitor (PARPi) olapaprib has shown life-­prolonging effects. Thus,  the  olapaprib  is  now  a  FDA-­approved  monotherapy  for  gBRCAm  TNBC  patients.  These  findings  are  highly  significant, as they endorse the concept that genetic defects in HDR pave the way to cancer cell killing by PARPi  that prevent single strand DNA repair. Only 15% of all TNBC patients are gBRCAm carriers, with the remaining  85%  of  gBRCAm-­negative  TNBC  showing  inconsistent  responses  to  PARPi  despite  BRCA-­like  phenotypes  (BRCAness). This signifies the Research Plan presented herein as it proposes to induce HDR-­deficiency through  Rad51 inhibition, which then in turn amplifies PARPi efficacy. We have identified a novel class of HDR-­inhibitors  that are fatty acids (NFA) nitroalkenes, which are well tolerated and readily deployable in humans. Our research  has  identified  a  unique  regulatory  domain  on  the  essential  HDR  gene  Rad51  that  is  controlled  by  reducing-­ oxidation  (redox)  post-­translational  modifications  (PTM)  and  can  be  readily  targeted  as  a  novel  chemotherapeutic  strategy  for  TNBC.  The  reversible  and  site-­specific  alkylation-­mediated  PTM  of  Rad51  by  a  lipid  electrophile  nitro  fatty  acid  (NFA)  severely  compromises  nuclear  Rad51  foci  and  TNBC  cell  survival,  especially  when  combined  with  PARPis  in  vitro  and  in  vivo.  Thus,  specific  focus  is  placed  on  tow  different  perspectives.  First,  detailed  mechanistic  understanding  will  come  from  characterizing  the  specificity  of  Rad51  alkylation by the NFAs and the impact on HDR. In addition, an efficacious NFA regioisomers designed from X-­ ray structure-­based modeling studies, that already showed increased TNBC cell killing, will be further evaluated  for  extents  of  Rad51  targeting,  inhibition  of  HDR  repair  in  combination  with  PARPi  and  net  effects  on  TNBC  killing in a TNBC cell line panel. As NFAs have the capacity to adduct protein Cys residues, and preliminary data  also  support  an  NFA-­mediated  inhibition  of  another  DNA  DSB  repair  pathway,  known  to  be  upregulated  after  Rad51  inhibition,  other  possible  NFA  protein  targets  in  DNA  DSB  repair,  will  be  examined  by  click-­chemistry  based  HPLC-­MS/MS  proteomic  analysis  of  NFA  targets.  Secondly,  a  TNBC  patient-­derived  xenograft  breast  cancer  model  in combination  with  a  genetically  engineered  TNBC  mouse  model,  will  facilitate  more  clinically  relevant effects of NFAs, in combination with PARPi, ex and in vivo. The Research Plan will reveal a novel drug  strategy  for  TNBC  therapy,  where  the  inhibition  of  Rad51-­mediated  DNA  repair  by  NFAs  renders  TNBC  cells  more sensitive to PARP inhibition thus increasing TNBC cell killing.