Endogenous ligand of the NK activating receptor NKp46

点击翻译按钮获取中文摘要

Natural killer cells (NK) act as a first line of defense against infection and cancer. NK activation is controlled by  a  balance  of  signals  transmitted  by  activating and  inhibitory  NK  receptors.  The  activating  receptor  NKp46  is  considered  the  major  activating  receptor  in  natural  cytotoxicity  against  autologous,  allogeneic  and  xenogeneic  target  cells.  NKp46  is  conserved  in  mammals  and  virtually  ubiquitously  expressed  on  NK,  suggesting  it  is  functionally  important.  Mice  deficient  in  Ncr1,  the  gene  encoding  NKp46,  are  impaired  in  tumor  immune  surveillance, have more severe influenza A, metapneumovirus, reovirus and fusobacterium infections and graft  versus  host  disease.  The  endogenous  ligand  of  this  important  activating  NK  receptor  is  not  known,  despite  decades  of  searching.  Our  preliminary  work  suggests  that  NKp46  recognizes  calreticulin  (CRT),  which  is  normally found inside the endoplasmic reticulum (ER) but gets transferred to the cell surface in ER-­stressed cells  or  tumor  cells  treated  with  some  cancer  drugs. An  NKp46-­Ig  fusion protein  specifically  pulls  down cell-­surface  CRT  (ecto-­CRT)  and  preliminary  data  using  surface  plasmon  resonance  indicate  specific  binding.  Knocking  down  CALR,  the  gene  encoding  for  CRT,  or  adding  blocking  antibodies  to  CRT  inhibits  NKp46-­mediated  NK  killing. Some chemotherapeutic agents and radiotherapy induce an immunostimulatory type of programmed cell  death  in  cancer  cells,  known  as  immunogenic  cell  death  (ICD),  which  removes  surviving  tumor  cells  after  treatment.  The  mechanism behind  ICD has been linked  to ecto-­CRT,  which  serves  as  an  “eat  me”/phagocytic  signal for dendritic cells, which then activate anti-­tumor CD8+ T cells by cross-­priming. Here we hypothesize that  NKp46 recognizes ecto-­CRT, and that NK recognition of ER-­stressed cells via NKp46 interaction with ecto-­CRT  plays an important role in ICD and NK-­mediated immune defense more generally. In preliminary data, infection  with ZIKV, which replicates in the ER and causes ER stress, and treatment of tumor  cell lines with ICD-­inducing  chemotherapy  drugs  induces  ecto-­CRT  and  NKp46-­dependent  NK  killing.  Moreover,  CRT-­coated  tumor  cells  become NK cell targets, and NCR1 knockout in an NK cell line strongly inhibits its killing of targets with exposed  CRT.  To  test  our  hypotheses,  we  will  first  confirm  that  ecto-­CRT  is  a  ligand  for  NKp46  by  using  biophysical  methods  to  characterize  ecto-­CRT  and  NKp46  binding  and  identifying  the  regions  of  CRT  responsible  for  the  interaction. Genetic  manipulation or  blocking of  NKp46 on  NK and of  ecto-­CRT  on tumor targets  will  examine  the role of this receptor-­ligand interaction in NK recognition, immune synapse formation and functional responses  to  infected  and  tumor  cells.  NK  killing  of  untreated  tumor  cells  and  tumor  cells  treated  with  ICD-­inducing  and  noninducing drugs will be compared. The in vivo role of NKp46 in controlling ZIKV infection and mouse tumors  (without and with chemotherapy) will be assessed by comparing viral levels and tumor growth, NK cell infiltration  of tumors and survival in wild-­type and Ncr1-­/-­ mice.