IN VIVO OXIDATIVE DNA DAMAGE IN CULTURED MAMMALIAN CELLS

培养哺乳动物细胞体内 DNA 氧化损伤

基本信息

  • 批准号:
    3421576
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 16.36万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    1991
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    1991-08-06 至 1994-08-05
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

Oxygen free radicals are believed to be among the major possible causative agents of a number of pathological conditions such as cancer, aging, arthritis, emphysema and infant retinopathy among others. One mode of action of oxygen-derived species is to cause DNA lesions, resulting in cell mutation or death. The goal of this study is to quantitatively establish the extent to which oxygen free radicals are responsible for in vivo DNA damage in cultured mammalian cells. A model murine hybridoma system producing monoclonal IgG antibodies has been chosen for our studies. In order to attain our objective, the following specific questions will be answered sequentially: i) Can oxidative DNA lesions be quantitatively measured in chromatin? Contemporary measurements of chemical modifications to DNA have been made on isolated DNA, which do not portray a realistic picture of actual damage occurring at the chromatin level. This is because DNA present in chromatin is structurally sequestered and bound to histones. Furthermore, present state-of-the-art measurements of DNA damage in mammalian cells consist primarily of identifying strand breakage. There is a need for a more powerful and quantitative assay. A superior approach is available through the use of Gas Chromatography/Mass Spectrometry techniques to precisely and quantitatively identify DNA lesions. Several base products have been identified through this technique by exposing isolated DNA to free radical attack. It is proposed to expose isolated intact chromatin to free radical attack under controlled conditions and subsequently characterize the damage. ii) Are the same lesions found in cells in vivo? This question has not been addressed to any significant degree in mammalian cells. We propose to use in vitro bioreactor culture techniques, which allow for the precise control of all environmental and physiological factors. Live cells in controlled environments will be exposed (as in the case of isolated chromatin) to known free radical generating systems. Based on the methodology developed to answer the first question, this approach will permit accurate studies of in vivo DNA damage in cultured mammalian cells. Additionally, it will be possible to study the kinetics of DNA repair by monitoring the temporal disappearance of damaged bases from cellular chromatin after exposing cells to free radicals. In addition to having a major impact on contemporary research in the field of oxygen toxicity, this work will assist in meeting the objectives of the RFA by not only developing hybridomas as a high connectivity mammalian system but also in promoting the use of in vitro tissue culture experiments as an alternative to animal use. In the longer term, the studies proposed here will lay the groundwork for understanding conditions and mechanisms by which oxidative DNA damage and subsequent repair occurs in mammalian cells.
氧自由基被认为是主要的可能 许多病理状况如癌症的病原体, 老化、关节炎、肺气肿和婴儿视网膜病等。 一 氧衍生物质的作用模式是引起DNA损伤, 导致细胞突变或死亡。 本研究的目的是 定量地确定氧自由基在多大程度上 在培养的哺乳动物细胞中负责体内DNA损伤。 模型 产生单克隆IgG抗体的鼠杂交瘤系统已经被 选择我们的研究。 为了实现我们的目标, 具体问题将按顺序回答: i)氧化DNA损伤可以定量测量吗? 染色质?DNA化学修饰的现代测量 都是在分离的DNA上进行的,这并不能描绘出一幅真实的画面。 在染色质水平上发生的实际损伤。 这是因为DNA 存在于染色质中的蛋白质在结构上被隔离并与组蛋白结合。 此外,目前最先进的DNA损伤的测量, 哺乳动物细胞主要包括识别链断裂。 那里 需要一种更有效的定量分析方法。 上级 方法是通过使用气相色谱/质谱 光谱分析技术用于精确和定量地鉴定DNA 病变 通过这一点,已经确定了几种基础产品 技术通过暴露分离的DNA自由基攻击。 是 建议将分离的完整染色质暴露于自由基攻击, 控制条件并随后表征损坏。 ii)在体内细胞中是否发现相同的病变?这个问题 在哺乳动物细胞中还没有达到任何显著的程度。 我们 建议使用体外生物反应器培养技术, 精确控制所有环境和生理因素。生活 在受控环境中的细胞将被暴露(如在 分离的染色质)与已知的自由基生成系统。 基于 为回答第一个问题而开发的方法, 将允许在培养的哺乳动物中精确地研究体内DNA损伤 细胞 此外,将有可能研究DNA的动力学, 通过监测受损碱基的暂时消失进行修复, 在细胞暴露于自由基后,细胞染色质。 除了对当代研究产生重大影响外 在氧毒性领域,这项工作将有助于满足 RFA的目标不仅是开发杂交瘤作为一种高水平的 连接哺乳动物系统,而且在体外推广使用 组织培养实验作为动物使用的替代品。 在 从长远来看,这里提出的研究将为以下方面奠定基础: 了解氧化性DNA损伤和 随后的修复发生在哺乳动物细胞中。

项目成果

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