小鼠中来源于mRNA的piRNA的生成机理研究

piRNAs are a novel class of small RNAs that were specifically produced from germ cells in large quantities. piRNAs that map to repetitive sequences were generated from retrotransposon RNAs, therefore their production is tightly coupled to its function. However, the mechanism for the production of other types of piRNAs and their functions are largely unknown. In our previous studies, we profiled the expression of small RNAs at three important stages of mouse spermatogenesis (spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids) and performed in-depth bioinformatics analysis of the sequences of piRNA and their precursors. We found that about one-third of mRNAs were potential precursors of piRNAs, and named such mRNAs as PRMRs. Sequences of PRMRs were more conserved evolutionarily, possessed more splice isoforms and more antisense transcripts compared with non-PRMRs. In the present application, we are planning to investigate how piRNAs are processed from PRMRs. We will examine how antisense transcripts and alternative splicing are related to piRNA generation. We will also examine whether there is any sequence motif(s) and novel protein factors that may play a role in the production of piRNAs. These results will contribute to people's understanding of the production and function of small RNAs.

piRNAs是近年来发现的一类在生殖细胞中特异且大量表达的小RNAs。目前该领域的研究表明，来源于重复序列的piRNAs可能在生成的同时也降解了逆转座子的RNAs，从而其生成和功能紧密相关。而其他类型piRNAs的生成机制和功能还不清楚。我们在前期研究中检测了小鼠精子发生过程三个重要阶段（精原细胞、精母细胞、圆形精子细胞）小RNAs的表达谱，利用生物信息学方法对piRNAs进行了系统分析。发现生殖细胞中约有三分之一的mRNAs能剪切产生piRNAs（这类mRNAs被命名为PRMRs）。PRMRs在物种间很保守，富含反义转录本，并且含有更多剪接变体。在本申请中，我们计划用体外培养的精原干细胞（SSCs）来研究PRMRs加工生成piRNAs的可能机制，研究反义转录本和RNA剪接在该过程中的作用，鉴定piRNA前体中与piRNAs生成有关的特征序列和结合蛋白。

小鼠生精过程中存在mRNA和非编码RNA的复杂调控网络，非编码RNA包括lncRNA、piRNA、miRNA和circRNA等。我们首先使用小鼠不同时期生殖细胞的高通量测序数据及我们开发的工具分析了转录本的表达模式、相互关系与转录调控。我们发现mRNA和lncRNA表达模式可分为三类，circRNA与piRNA的表达是有序的调控过程；初步使用小规模的筛选方法找到了4个可能有功能的lncRNA；使用转录因子分析工具，我们发现mRNA与lncRNA的表达受转录因子家族的调控，并选取了转录因子CREM与Rfx2进行实验或测序验证，确定一批受其调控的基因。通过前期的生物信息分析，我们选取了睾丸特异的miR-202作为研究对象。qPCR结果显示miR-202-3p和miR-202-5p均在睾丸中特异表达，并且在生精过程中具有不同的表达模式；miR-202受GDNF和RA调控。抑制实验显示抑制miR-202-3p会导致体外培养的精原干细胞（SSC）向下分化。使用Cas9和双gRNA，我们建立了诱导敲除miR-202的SSC系，结果显示诱导敲除会导致SSC向下分化，细胞数急剧减少，最终导致体内精子发生受影响。通过蛋白质谱和RNA-seq分析，我们发现敲除会导致SSC细胞周期上调，实验证明其增殖和凋亡均上调。两个RNA结合蛋白-Rbfox2和Cpeb1为miR-202的靶基因，部分介导了miR-202的功能；我们发现Rbfox2对于减数分裂的起始是必需的。我们前期的工作显示，精原细胞时期有大量mRNA可产生piRNA，并且显著富集反义转录本lncRNA。前期的生物信息分析显示，可产生piRNA的mRNA表达随精子发生进行表达下调，而lncRNA表达上调，并且lncRNA与mRNA互补区域有大量piRNA存在；与之相比，总mRNA及其对应的lncRNA表达均上调，暗示着此三者可能存在相互调控关系。我们将选取几个piRNA前体mRNA来研究piRNA功能及其作用机制，例如Hist1h4b。

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