脱腺苷酸化酶CCR4和CAF1同工酶的不同性质、相互作用和功能研究

脱腺苷酸化酶通过调节mRNA的poly(A)尾巴的长度，在mRNA代谢中起着重要作用，并广泛参与了多种细胞生命活动的调节。在各种生物体内，通常都存在着几种到几十种脱腺苷酸化酶，而在各种脱腺苷酸化酶中，CCR4和CAF1参与形成的CCR4-NOT复合体被认为是一个广泛参与细胞稳态和应激的平台。然而，在这个快速发展的领域中，一个一直悬而未决的问题就是：为什么细胞需要如此众多的特异性降解poly(A)的酶，而且高等生物中通常存在着更多种类的脱腺苷酸化酶。围绕着这个科学问题，本项目主要研究CCR4-NOT复合体中的两个脱腺苷酸化酶CCR4和CAF1各种同工酶的酶学特征、稳定性、细胞定位、参与的复合体形成、结构基础以及细胞功能，取得了以下成果：1）建立了脱腺苷酸化酶的一种新的SEC测活方法。我们的研究表明，SEC测活法可以用于寡聚和多聚腺苷酸的测活，可以进行酶促反应动力学分析，而且可以用于脱腺苷酸酶的催化反应方式分析。通过设定合适的对照，SEC测活法可以用于各种脱腺苷酸化酶的测活，可以用于复杂反应体系如蛋白质混合物和全细胞裂解液的测活；2）到目前为止，对脱腺苷酸化酶的结构和功能研究主要是在动物细胞和酵母中进行的，对植物中脱腺苷酸酶的性质研究的非常少。我们克隆了莱茵衣藻的crcaf1基因和杜氏盐藻的dscaf1基因。初步功能研究显示dscaf1基因可能通过转录调控快速响应胁迫，从而在mRNA代谢水平上有利于盐藻适应高盐、高温、低温、高光和紫外等极端环境中的生存；3）利用shRNA技术在胃癌细胞系MKN28中筛选了hCaf1a/hCaf1b和hCCR4a/hCCR4b四种同工酶的稳定敲低细胞系，发现四种脱腺苷酸化酶敲低以后对细胞周期具有迥异的影响，暗示hCaf1a/hCaf1b和hCCR4a/hCCR4b这四种主要的脱腺苷酸化酶可能大部分都参与了细胞周期调控，但具有不同的分子机制；4) 发现hCaf1a/hCaf1b和hCCR4a/hCCR4b的同工酶具有不同的结构特征、酶活力、金属离子依赖性和细胞内定位，研究结果显示不同的脱腺苷酸化酶同工酶并非采用同一个机制被招募到细胞内小体中。这些研究结果为探索脱腺苷酸化酶多样性的生理功能提供新的线索。