具跨膜特性的番茄斑萎病毒30K移动蛋白NSm的拓扑结构及其移动分子机制研究

Current reports for transmembrane movement protein are all from the smaller molecular weight proteins. The transmembrane topology of movement protein from 30K family has not been reported previously. Our preliminary studies show that the non-structural protein NSm (30K movement protein) encoded by Tomato spotted wilt virus (TSWV) has characteristics of transmembrane protein. Based on those findings, combined with the current studies on viral membrane protein and recent progress on the mechanism of viral movement, this project intends to use the integrated approaches of molecular biology, cell biology, biochemistry and plant virology to reveal the transmembrane topology and related molecular trafficking mechanisms of TSWV NSm movement protein. The project is to determine transmembrane biochemical characteristics of TSWV NSm and to identify transmembrane domain of NSm, to reveal a transmembrane topology of TSWV NSm and to determine whether TSWV NSm integrated into specific microdomains on the membrane, to understand the regulatory mechanisms of TSWV NSm transport from the endoplasmic reticulum to the plasmodesmata. The scienctific significance of this project will not only help to understand the movement mechanism of the plant negative stranded RNA virus, but also help to reveal the transmembrane topology of movement protein from 30K family.

目前跨膜移动蛋白的报道都来自于分子量较小的移动蛋白，30K移动蛋白家族中还没有具跨膜特性的移动蛋白拓扑结构的报道。申请人课题组的前期研究表明番茄斑萎病毒(TSWV)编码的非结构蛋白NSm是一个具跨膜特性的30K移动蛋白，本项目拟在已有研究基础之上，结合当前病毒膜蛋白研究和移动蛋白转运机制的前沿研究进展，通过分子生物学、细胞生物学、生物化学和植物病毒学等多学科的手段来系统地揭示TSWV 30K移动蛋白NSm的拓扑结构及相关移动分子机制，明确NSm在膜上的生化特性及膜整合结构域，解析NSm在内膜上的拓扑结构，确定NSm是否整合到内膜系统上的特定微结构域，探明NSm作为具有跨膜特性的移动蛋白从内质网膜定位到胞间连丝是否具有独特的移动机制。本项目的实施对于认识植物负义链RNA病毒的移动蛋白和病毒的转运机制具有重要的科学意义，同时也将有助于了解30K家族具跨膜特性的移动蛋白拓扑结构及移动机制。

Tospovirus是一种三分体负链RNA病毒，被认为是最具破坏性的植物病毒之一。番茄斑萎病毒（TSWV）是该属的典型成员，TSWV编码的NSm蛋白在病毒细胞间和长距离运动中起着关键作用。植物病毒可以使用不同的宿主细胞运输机器通过胞间连丝从一个细胞移动到另一个细胞，宿主细胞转运系统对包括tospoviruses在内的多部分负链RNA植物病毒的细胞间运动的机制都知之甚少。我们利用番茄斑萎病毒作为模型来了解tospoviruses的细胞间运动机制。利用碱性提取（0.1M碳酸钠），盐（1M氯化钾）和4M尿素处理方法发现NSm蛋白紧密地与细胞膜相结合，用Triton X-114处理NSm的膜组分进一步表明NSm紧密地粘附在细胞内的膜结构上。发现TSWV NSm既不是一个外周膜蛋白，也没有一个典型的整合膜蛋白，相反，该蛋白具有一些插入膜的能力，并紧密地粘附在细胞内的膜结构上。发现TSWV NSm定位于与寄主植物中的内质网（ER）。植物中的ER膜是独特的结构，其通过胞间连丝的ER在相邻细胞之间连接，并在整个植物中形成连续的网络。将NSm-GFP融合蛋白在单叶细胞中瞬时表达时，该融合蛋白可以单独运输到相邻细胞中。将NSm与ER的结合位点进行突变则导致其错误定位于其他亚细胞位点并抑制其进行胞间运输。药剂破坏ER网络则严重抑制NSm-GFP运输但不抑制GFP的自由扩散。在ER网络受损的拟南芥突变体rhd3中，NSm-GFP的胞间移动显着减少，而GFP扩散不受影响。我们的研究还表明ER-to-Golgi分泌途径和细胞骨架转运系统不参与TSWV NSm的细胞间运输。 更为重要的是，在ER缺陷型rhd3突变体中TSWV侵染扩散显著延迟，并且这种病毒感染减少不是由于复制减少引起的。我们还鉴定了分子伴侣NbSGT1与TSWV NSm相互作用，TSWV感染显着上调NbSGT1基因的表达，并且本氏烟叶片中过表达NbSGT1加速TSWV的感染。相反，沉默NbSGT1基因表达则强烈抑制TSWV NSm在本氏烟中的细胞间运动和系统感染。此外，发现NbSGT1也调控美洲型和欧亚型tospoviruses的胞间移动和系统感染。我们的研究结果对于tospoviruses和其他多分体负链RNA植物病毒的细胞间运输的机制研究具有重要的意义。

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