CsDAM基因在茶树越冬芽休眠调控中的作用机制

Tea plant (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) is a perennial evergreen woody plant. The dormancy formation and release of overwintering buds affect its safe hibernation and spring sprouting phenophase. DAM (Dormancy associated MADS-Box) plays crucial roles in dormancy regulation of perennial plants, however, the action mechanism of DAM has not been studied in evergreen plant. Our previous study shows that, CsDAM genes were differentially expressed during winter dormancy transitions, and also their expression patterns and genomic structures were different with the DAMs in deciduous woody plants. In this research, we propose to preform comprehensive expression analyses using multiple cultivars with varied sprouting phenophase to illuminate the roles of CsDAMs in tea plant dormancy; and then identify the genes function through poplar transformation system using overexpressing and inducible expression vectors; detect the responses of CsDAMs promoter to different treatments and the histone modification in CsDAMs regulation regions by CHIP-qPCR to finally reveal the expression regulation mechanism of CsDAMs during winter dormancy transition. This research proposal aims to illuminate the acting mechanism of CsDAMs in bud dormancy transition and provide valuable conclusions for genetic improvement of sprouting phenophase in tea plant and better understanding of dormancy mechanism in perennial evergreen woody plant.

茶树是多年生常绿木本植物，越冬芽休眠的形成及解除是影响其安全越冬和春季萌发早晚的一个重要因素。DAM是参与多年生植物冬季休眠调控的一个关键基因，但在常绿植物休眠调控中的作用机理未见报道。项目组前期研究结果表明，茶树CsDAMs基因在冬季休眠形成和解除的不同时期存在显著的表达差异，且与已知落叶木本植物中的DAM基因相比，其基因结构和表达模式明显不同。本研究拟通过分析CsDAMs基因在不同萌发物候型茶树休眠形成和解除过程中的表达变化，明确该基因与茶树休眠的关系；构建过表达和诱导表达载体，利用杨树转化体系验证该基因的功能；采用CHIP-qPCR检测基因调控区染色质的组蛋白修饰变化，结合启动子响应性分析，揭示CsDAMs基因在茶树休眠形成和解除阶段的表达调控模式。深入阐明CsDAMs调控茶树越冬芽休眠的作用机理，为今后茶树物候期的遗传改良和揭示多年生常绿木本植物休眠机理提供理论依据。

茶树冬季休眠研究有重要的生物学意义和经济意义，本项目围绕CsDAMs 基因在茶树越冬芽休眠形成和解除中的作用及其表达调控机制这一科学问题开展研究。基于茶树基因组信息和同源性分析在基因组水平鉴定2个DAM基因（CsDAM1和CsDAM2）；亚细胞定位及表达分析表明，CsDAM1和CsDAM2为核定位转录因子，在芽、叶等营养组织有高表达，存在明显的昼夜表达节律，在越冬芽中的表达模式与芽的休眠状态密切相关；基因克隆及结构分析表明，CsDAM1和CsDAM2有着相似的基因结构，但基因长度存在明显差异且与其它已知DAM基因结构不同；以4个早生茶树品种和4个晚生茶树品种为材料，冬季不同休眠阶段及人工休眠诱导表达分析表明，CsDAM1在不同萌发物候茶树越冬芽中存在相似的表达模式，在茶树萌发阶段的上调表达与茶树萌发物候密切相关。在杨树中过表达CsDAM1和CsDAM2基因并进行休眠诱导（短日照）和低温（4℃）胁迫条件下的表型鉴定，结果表明CsDAM1过表达杨树对低温敏感，而在休眠诱导条件下则表现出生长促进作用，但是CsDAM2过表达杨树未表现出明显的表型变化；基于RNA-seq的过表达杨树差异表达谱分析表明，CsDAM1可能主要通过调控植物细胞分裂和胞间物质交流相关的生物学过程影响植物表型；对其下游关键转录因子深入的表达分析和功能鉴定进一步揭示了CsAIL和CsSOC在茶树休眠调控中的重要作用。在启动子序列分析的基础上，利用酵母单杂筛选、一对一验证和EMSA分析，最终筛选并验证CsCBF和CsZHD9是CsDAM1的上游调控因子。利用转录激活相关的组蛋白甲基化和乙酰化修饰特异性抗体（H3K4me3和H3K27ac），Western blot和CHIP-Seq分析表明，在越冬芽休眠解除阶段基因转录激活的表观遗传修饰明显增强，CsDAM1编码区存在显著的组蛋白修饰peaks，表明该基因在受上游转录因子直接调控的同时，还受表观遗传的精细调控。综合以上研究结果我们提出了茶树CsDAM调控休眠的分子模型，深入阐释了茶树春季萌发的作用机制，为茶树物候期的遗传改良和揭示多年生常绿木本植物休眠机理提供了重要理论依据。

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