Regulation des Phosphoinositmetabolismus und der Clathrin-abhängigen Endozytose an chemischen Synapsen

磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸（PIP2）的调控作用[j] . Membrantransportvorgänge [j] .网格蛋白-vermittelte内切酶和外切内切酶循环突触剂Vesikel。磷脂酰肌醇4-磷酸5激酶（PIPK）和磷脂酰肌醇-磷酸合酶（Synaptojanin）。jngste Studien konnten zeigen, ass aktivitätsabhängige Änderungen im exo-endozytotischen Recycling synaptischer Vesikel mit erhöhten PIP2-Konzentrationen im präsynaptischen Kompartiment einhergehen。大北sohl - regulatorische protein - wehselwirkungen也包括NMDA-Rezeptor-induzierte NO/ cGMPabhängige逆行信号通路。[3][2][2][1][2][2][2][2][2][3][4][3]。因此，本文研究了PIPK与Arf6和AP-2的相互作用及其分子特性，并对其相互作用进行了分析。Ferner sollen die NO和cGMP的有效性研究Aktivität，磷酸化磷酸化状态研究和die subzelluläre FP2-代谢酶PIPK类型和Synaptojanin基因的定位研究。磷脂脂代谢调节酶（phosphoinositilidmetabolisierender Enzyme）也与Arf6， Talin， AP-2和Endophilin等蛋白结合和调节有关。翻译后修饰酶与酶与酶的结合伙伴können <s:2>现代质量光谱测量学（mass - spktrometrische Verfahren） aufgeklärt和hernach函数（hernach functionell characterterisierden）。用planenferner prä- and postsynaptische zielprotein von NO and cGMP mitels cGMP- and Phosphoprotein- Affinitätschromatographie， 2D-Gel and MS分析，和亚细胞蛋白质组学生物化学鉴定和功能特征。Um Änderungen der FP2-Konzentrationen in lebenden Zellen zu verfolgen, soll ein fret - basiter lebendzel - assay etabliert werden。schließ ßlich ist vorgesehen， die functioneile Bedeutung NO-induzierter Änderungen des FP2-Metabolismus und der daran beteiligerter effektorprotein durh组合药理学家（NO-Donor, NO-Scavenger, guanyyl - zykase - inhibitoren）， zellbiologischer (Recycling- and lokalisationstuden studen in transfizierten Primärkultur-Neuronen)，生化家（applied at - peptide transduzierter inhibitorprotein in Synaptosomen），和optischer Methoden (FM Farbstoff Recycling)，PH-EGFP-Lebendzellmikroskopie & FRET)在Synaptosomen和lebendenneuronen zu untersuen中的表达。

Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphospat(PIP2) reguliert u.a. Membrantransportvorgänge wie die Clathrin-vermittelte Endozytose und das exo-endozytotische Recycling synaptischer Vesikel. Dabei unterliegt der Phosphoinositmetabolismus der regulatorischen Kontrolle FP2- metabolisierender Enzyme wie der Phosphatidylinositol 4-Phosphat 5-Kinase (PIPK) sowie der Phosphoinositolphosphat-Phosphatase Synaptojanin. Jüngste Studien konnten zeigen, dass aktivitätsabhängige Änderungen im exo-endozytotischen Recycling synaptischer Vesikel mit erhöhten PIP2-Konzentrationen im präsynaptischen Kompartiment einhergehen. Dabei sowohl regulatorische Protein-Protein-Wechselwirkungen als auch NMDA-Rezeptor-induzierte NO/ cGMPabhängige retrograde Signalkaskaden von besonderer Bedeutung zu sein. Im Rahmen dieses Projektes sollen molekulare Mechanismen der Regulation des Phosphoinositmetabolismus und sowie deren Auswirkungen auf das Recycling synaptischer Vesikel untersucht werden. So soll die Interaktion der PIPK mit Arf6 und AP-2 molekular charakterisiert und zur Erzeugung interaktionsdefizienter Mutanten genutzt werden. Ferner sollen die Effekte von NO und cGMP auf die Aktivität, den Phosphorylierungsstatus und die subzelluläre Lokalisation der FP2- metabolisierenden Enzyme PIPK Typly und Synaptojanin getestet werden. Dies beinhaltet Studien zur Regulation und Aktivität o.g. Phosphoinositlipid-metabolisierender Enzyme als auch deren Bindung an Regulatorproteine wie Arf6, Talin, AP-2 oder Endophilin. Posttranslationale Modifikationen dieser Enzyme und ihrer Bindungspartner können über moderne massenspktrometrische Verfahren aufgeklärt und hernach funktionell charakterisiert werden. Wir planen ferner prä- und postsynaptische Zielproteine von NO und cGMP mittels cGMP- und Phosphoprotein- Affinitätschromatographie, 2D-Gel und MS Analyse, und subcellular Proteomics1 biochemisch zu identifizieren und funktioneil zu charakterisieren. Um Änderungen der FP2-Konzentrationen in lebenden Zellen zu verfolgen, soll ein FRET-basierter Lebendzell-Assay etabliert werden. Schließlich ist vorgesehen, die funktioneile Bedeutung NO-induzierter Änderungen des FP2-Metabolismus und der daran beteiligten Effektorproteine durch Kombination pharmakologischer (NO-Donor, NO-Scavenger, Guanylyl-Zyklase-Inhibitoren), zellbiologischer (Recycling- und Lokalisationsstudien Studien in transfizierten Primärkultur-Neuronen), biochemischer (Applikation TAT-peptidtransduzierter Inhibitorproteine in Synaptosomen), und optischer Methoden (FM Farbstoff Recycling, PH-EGFP-Lebendzellmikroskopie & FRET) in Synaptosomen und lebenden Neuronen zu untersuchen.