Struktur und Dynamik des DNA-mismatch-Reparatursystems aus Escherichia coli

DNA修复（DNA-Fehlpaarungs-Reparatur，MMR）是一种快速的基因稳定性保护系统。系统的扩展最好是在第一行中，使用DNA聚合物的方法来检测和处理。Trotz vorhandener Strukturen und intensiver Forschung an diesen Proteinen ist eine wesentliche Frage zum Mechanismus der MMR immer noch ungeklärt.通过效应蛋白的MutS和激活作用获得的Fehlpaarungs-Erkennung效应如何，ATP-水解酶的作用如何？我们已经开始着手研究蛋白复合物的结构，并通过体外（突变分析和交联）和计算机模拟（蛋白质对接和蛋白质对接）进行评估。在这一过程中，我们将研究蛋白质-DNA-和蛋白质-构象在前体中的结构和动力学。在一个ATP-水解-吸附过程中，可使Fehlpaarung和activiert从一个更好的蛋白质修复过程中恢复。我们将在MutS中增强Fehlererekennung和ATP-水解的相互作用，通过不同的方法：在处理、对照模型以考察失配-Erkennung和效应蛋白的激活性时，我们将停止一个系统的分析和DNA-底物的检验以确保不被破坏。我们将在下一阶段为功能和结构研究做准备。一个同源DNA的kovalent fixieren Zu diesem Zweck韦尔登wir Einzelcysteinvarianten von MutS generieren，die auch für die geplanten Untersuchungen zur Struktur und Dynamik des MutS Protein verwendet韦尔登. Hierzu韦尔登Spinmarkierungen für Hochfeld elektroparamagnetischen Resonanz（EPR）Messungen zur Bestimmungen von Abständen，zielgerichtete Einschränkung des Konformationsfreibrium durch crosslinking und lichtgesteuerte Konformationskontrolle durch sog.光开关交联剂是我们发现的。韦尔登通过试验验证了MutS控制的酶学活性和相互作用。

DNA-Fehlpaarungs-Reparatur (MMR) ist ein in fast allen Organismen vorhandenes System zur Sicherstellung der Genomstabilität. Die Aufgabe des Systems besteht in erster Linie darin, die seltenen Fehler der DNA-Replikationspolymerasen zu detektieren und zu beheben. Trotz vorhandener Strukturen und intensiver Forschung an diesen Proteinen ist eine wesentliche Frage zum Mechanismus der MMR immer noch ungeklärt. Wie erfolgt die Kopplung von Fehlpaarungs-Erkennung durch MutS und Aktivierung von Effektorproteinen und welche Rolle spielt dabei die ATP-Hydrolyse? Wir haben bereits damit begonnen, die Struktur der Protein-Komplexe mit Hilfe von in vitro (Mutationsanalysen und crosslinking) und in silico (Vorhersage von Interaktionsstellen und Protein docking) Verfahren zu bestimmen. In diesem Antrag stehen die Struktur und Dynamik der Protein-DNA- und der Protein-Konformationen im Vordergrund, wobei wir zunächst den Fokus auf das MutS Protein legen. MutS erkennt die Fehlpaarung und aktiviert in einem ATP-Hydrolyse-abhängigen Prozess eine Reihe von an der Reparatur beteiligter Proteine. Wir wollen die in MutS auftretenden Konformationsänderungen als Antwort der Fehlererkennung und ATP-Hydrolyse durch verschiedenen Methoden untersuchen: Um die vorhandenen, kontroversen Modelle zur Kopplung von mismatch-Erkennung und Aktivierung der Effektorproteine zu unterscheiden, halten wir eine systematische Analyse und Veränderung des DNA-Substrates für unabdingbar. Darüber hinaus wollen wir für Funktions- und Strukturstudien MutS in der Nähe der Fehlpaarung bzw. an Homoduplex-DNA kovalent fixieren. Zu diesem Zweck werden wir Einzelcysteinvarianten von MutS generieren, die auch für die geplanten Untersuchungen zur Struktur und Dynamik des MutS Protein verwendet werden. Hierzu werden Spinmarkierungen für Hochfeld elektroparamagnetischen Resonanz (EPR) Messungen zur Bestimmungen von Abständen, zielgerichtete Einschränkung des Konformationsfreiheit durch crosslinking und lichtgesteuerte Konformationskontrolle durch sog. photoswitch crosslinker ihre Anwendung finden. Ergänzt werden diese Experimente durch Assays, die die verschiedenen enzymologische Aktivitäten und Interaktionen von MutS kontrollieren.