Assaying Arginylation Activity in Cell Lysates Using a Fluorescent Reporter.
Assaying Arginylation Activity in Cell Lysates Using a Fluorescent Reporter.
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使用荧光报告仪测定细胞裂解物中的精氨酰化活性。
DOI：
10.1007/978-1-0716-2942-0_9
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发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Zhang,Fangliang
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Kumar,Akhilesh;Zhang,Fangliang
在这里，我们描述了一种基于抗体的方法来评估的酶活性的乙酰转移酶1（Ate 1）。该测定基于报告蛋白的腺苷酸化，该报告蛋白含有β-肌动蛋白的N-末端肽、Ate 1的已知内源性底物和C-末端GFP。报告蛋白的腺苷酸化水平在免疫印迹上用对腺苷酸化的N-末端具有特异性的抗体测定，而底物的总量用抗GFP抗体评估。该方法可方便、准确地检测酵母和哺乳动物细胞裂解液中Ate 1的活性。此外，该方法还可以成功地测定突变对Ate 1关键残基的影响以及胁迫等因素对Ate 1活性的影响。
Here, we describe an antibody-based method to evaluate the enzymatic activity of arginyltransferase1 (Ate1). The assay is based on the arginylation of a reporter protein, which contains the N-terminal peptide of beta-actin, a known endogenous substrate of Ate1, and a C-terminal GFP. The arginylation level of the reporter protein is determined on an immunoblot with an antibody specific for the arginylated N-terminus, while the total amount of substrate is evaluated with anti-GFP antibody. This method can be used to conveniently and accurately examine the Ate1 activity in yeast and mammalian cell lysates. Moreover, the effect of mutation on Ate1 critical residues and effect of stress and other factors on Ate1 activity can also be successfully determined with this method.
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