GYF-Domänen-vermittelte Protein-Wechselwirkungen

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GYF-Domänen klassifizieren eine in Eukaryonten vorkommende Familie von Protein- Interaktionsdomänen, die Prolm-reiche Sequenzen (PRS) erkennen. Das konservierte Tripeptid Glycin-Tyrosin-Phenylalanin (GYF) ist dabei Teil eines konservierten Strukturmotifs, das insbesondere unter Einbindung vieler aromatischer Aminosäuren zur Bindung des Liganden beiträgt. Die erste GYF-Domäne wurde in dem Protein CD2BP2 identifiziert und vermittelt die Bindung an CD2. Entsprechend wurde CD2 in den Kontext der CD2-abhängigen T-Zell- Signaltransduktion gestellt. Wir haben in den letzten Jahren die erste Struktur eines GYFDomänen- Ligandenkompl exes mittels NMR-Spektroskopie gelöst und für repräsentative GYFDomänen aus Hefe, der Acker-Schmalwand (A. thaliana) und Mensch eine umfassende Analyse der Mechanismen zur Erkennung von Prolin-reichen Sequenzen durchgeführt. Dabei konnten wir mit Hilfe des Phage Display und mittels der Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse wahrscheinliche zelluläre Interaktionspartner einiger GYF-Domänen-enthaltender Proteine verifizieren. Dieser Antrag hat nun zum Ziel, die neu gefundenen Interaktionen von GYF-Domänen zu charakterisieren und den möglichen funktionellen Zusammenhang, in dem GYF-Domänen eine Rolle spielen, weitergehend zu untersuchen. Insbesondere wollen wir die relative Bedeutung des CD2BP2-GYF-Proteins in der T-Zell-Signaltransduktion und in spliceosomalen Komplexen aufklären. Die Funktion des CD2BP2 in T-Zellen soll durch siRNA-Experimente in Kombination mit der Messung von Interleukin-2-Produktion und Phosphorylierungsmustern untersucht werden. Weitergehende Experimente werde wir dabei mit primären T-Zellen CD2- transgener Mäuse durchführen. Die vermutete Einbindung von GYF- und WW-Domänenenthaltenden Proteinen in spliceosomale Komplexe soll durch konfokale Mikroskopie und FRET-Analyse von CFP/YFP-Fusionen mit den entsprechenden GYFAVW-Proteinen und deren Bindungspartnern erforscht werden, Komplementär werden wir die Wechselwirkung der beteiligten Protein-Domänen NMR-spektroskopisch und biophysikattsch untersuchen, um die mikroskopischen Experimente durch mechanistische Modelle zu ergänzen und um herauszufinden, ob die Interaktionspartner unabhängig, kompetitiv oder kooperativ binden. Da wir für die GYF-Domäne des Hefe-SMY2-Proteins zum einen das Splicing-Protein MSL5 und zum anderen den Translationsfaktor EAP1 als Interaktionspartner gefunden haben, wollen wir in diesem Fall einen möglichen Zusammenhang dieser beiden Prozesse aufklären. Strukturell soll hier geklärt werden, inwieweit die S M Y2-GYF-Domäne, die im Vergleich zur CD2BP2-GYFDomäne eine veränderte C-terminale Domänengrenze aufweist, einen unterschiedlichen Faltungsmodus besitzt. Die NMR-Struktur der SMY2-GYF-Domäne im Komplex mit einem natürlichen Liganden soll gelöst, um die festgestellten Bindungseigenschaften auf struktureller Ebene zu verstehen. Da nach neueren Erkenntnissen dieser C-terminale, nicht-konservierte Teil der GYF-Domänen PRS-unabhängige Protein-Bindungseigenschaften besitzt, kann die Struktur als Ausgangspunkt für die Charakterisierung neuer GYF-Domänen-Bindungspartner dienen.