Struktur und Dynamik des DNA-mismatch-Reparatursystems aus Escherichia coli

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DNA-Fehlpaarungs-Reparatur (MMR) ist ein in fast allen Organismen vorhandenes System zur Sicherstellung der Genomstabilität. Die Aufgabe des Systems besteht in erster Linie darin, die seltenen Fehler der DNA-Replikationspolymerasen zu detektieren und zu beheben. Trotz vorhandener Strukturen und intensiver Forschung an diesen Proteinen ist eine wesentliche Frage zum Mechanismus der MMR immer noch ungeklärt. Wie erfolgt die Kopplung von Fehlpaarungs-Erkennung durch MutS und Aktivierung von Effektorproteinen und welche Rolle spielt dabei die ATP-Hydrolyse? Wir haben bereits damit begonnen, die Struktur der Protein-Komplexe mit Hilfe von in vitro (Mutationsanalysen und crosslinking) und in silico (Vorhersage von Interaktionsstellen und Protein docking) Verfahren zu bestimmen. In diesem Antrag stehen die Struktur und Dynamik der Protein-DNA- und der Protein-Konformationen im Vordergrund, wobei wir zunächst den Fokus auf das MutS Protein legen. MutS erkennt die Fehlpaarung und aktiviert in einem ATP-Hydrolyse-abhängigen Prozess eine Reihe von an der Reparatur beteiligter Proteine. Wir wollen die in MutS auftretenden Konformationsänderungen als Antwort der Fehlererkennung und ATP-Hydrolyse durch verschiedenen Methoden untersuchen: Um die vorhandenen, kontroversen Modelle zur Kopplung von mismatch-Erkennung und Aktivierung der Effektorproteine zu unterscheiden, halten wir eine systematische Analyse und Veränderung des DNA-Substrates für unabdingbar. Darüber hinaus wollen wir für Funktions- und Strukturstudien MutS in der Nähe der Fehlpaarung bzw. an Homoduplex-DNA kovalent fixieren. Zu diesem Zweck werden wir Einzelcysteinvarianten von MutS generieren, die auch für die geplanten Untersuchungen zur Struktur und Dynamik des MutS Protein verwendet werden. Hierzu werden Spinmarkierungen für Hochfeld elektroparamagnetischen Resonanz (EPR) Messungen zur Bestimmungen von Abständen, zielgerichtete Einschränkung des Konformationsfreiheit durch crosslinking und lichtgesteuerte Konformationskontrolle durch sog. photoswitch crosslinker ihre Anwendung finden. Ergänzt werden diese Experimente durch Assays, die die verschiedenen enzymologische Aktivitäten und Interaktionen von MutS kontrollieren.