Aufklärung der Katalysemechanismen und Regulation der bakteriellen Acetohydroxysäuresynthasen auf molekularer Ebene

在分子水平上阐明细菌乙酰羟酸合酶的催化机制和调节

• 批准号: 21951943
• 负责人: Professor Dr. Kai Tittmann
• 金额: --
• 依托单位: Göttinger Zentrum für Molekulare Biowissenschaften (GZMB)
• 依托单位国家: 德国
• 项目类别: Research Grants
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 德国
• 起止时间: 2005-12-31 至 2008-12-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://gepris.dfg.de/gepris/projekt/21951943?language=en
• 关键词: Aufkl; rung; der; Katalysemechanismen; und

Im Gegensatz zum tierischen Organismus können Pflanzen und Bakterien die verzweigtkettigen Aminosäuren Valin, Leucin und Isoleucin sowie das daraus abgeleitete Coenzym A de novo synthetisieren. Der erste Schritt der komplexen Reaktionskaskade wird dabei von der Acetohydroxysäuresynthase (AHAS) katalysiert. Die AHAS besteht aus zwei katalytischen und zwei regulatorischen Untereinheiten und hat im aktiven Zentrum die Cofaktoren Thiamindiphosphat und FAD gebunden. Am Thiamin-Cofaktor erfolgt die enantioselektive Ligation vom Donorsubstrat Pyruvat mit den alternativen Akzeptoren Pyruvat oder Ketobutyrat unter Bildung von Acetolaktat bzw. Acetohydroxybutyrat. Die Rolle des an der physiologischen Reaktion unbeteiligten Flavins ist bis dato unverstanden. Zwei der in summa drei bakteriellen Isoenzyme werden durch die Aminosäure Valin nach Bindung an die regulatorische Untereinheit im Sinne einer Feedback- Inhibierung gehemmt. Eine Reihe von kommerziell genutzten Herbiziden unterschiedlicher Wirkstoffklassen sind hocheffiziente Inhibitoren der AHAS. Ziel unserer Untersuchungen ist die Aufklärung der Mechanismen von Katalyse und Regulation durch Metabolitrepression und Herbizidinhibitoren auf molekularer Ebene. Zu diesem Zweck sollen die mikroskopischen Geschwindigkeitskonstanten aller enzymatischen Teilschritte durch eine neuartige NMR-spektroskopische Intermediatanalysemetnode bestimmt werden. Diese Methode stellt zur Zeit die einzige Möglichkeit dar, alle Intermediate der katalytischen Sequenz Thiamin-abhängiger Enzyme simultan und direkt zu delektieren. Die vermutlicherweise veränderte Verteilung von Reaktionsintermediaten in Anwesenheit von Effektoren erlaubt daher erstmals Rückschlüsse darauf, in welcher Art sich die inhibitorische Wirkung von Valin bzw. Herbiziden auf katalytischer Ebene manifestiert. Durch i) kinetische NMR und stopped-flow Studien an Enzymvarianten mit Aminosäureaustauschen im aktiven Zentrum und in der valinbindenden regulatorischen Untereinheit und ii) Röntgenkristallographie des Holoenzymkomplexes sollen sowohl die an der Bindung der Effektoren als auch die am Informationstransfer vom regulatorischen zum aktiven Zentrum beteiligten Aminosäureseitenketten identifiziert und ein chemisches Modell für die Effektorwirkung vorgeschlagen werden. Weiterhin soll untersucht werden, welche Aminosäureseitenketten die hohe Enantioselektivität und hohen apparenten Spezifitäten für Donor- und Akzeptorsubstrat bestimmen, da die Substrat-Präferenz der AHAS entscheidend für das relative Konzentrationsverhältnis der verschiedenen verzweigtkettigen Aminosäuren in der Zelle ist. Die intrinsische Reaktivität und katalytische Kompetenz des an der physiologischen Reaktion unbeteiligten Flavincofaktors soll durch Bestimmung des Mittelpunkt-Redoxpotentials und der thermodynamischen und kinetischen Stabilisierung von radikalischen Flavinsemiquinon-Spezies analysiert werden. Diese Ergebnisse versprechen Aufschluss darüber, in welcher Art die Enzymkomponente die Reaktivität eines Cofaktors kinetisch und/oder thermodynamisch unterdrückt, um eine konkurrierende Parallelreaktion zu favorisieren.

我是Gegensatz zum tierischen Organismus könnnen Pflanzen and Bakterien die verzweigtkettigen Aminosäuren Valin，Leucin and Isoleucin Sowie das Daraus abgeleitete Cozym A de nevo Syntisieren。[中英文摘要][中英文摘要]乙酸羟基合酶(AHAS)。这是因为监管机构对硫代磷酸盐和硫代磷酸盐的监管中心是这样的。Am硫胺-Cofaktor erfolgt对映体选择性配基vom或底物在麻省理工学院的Den替代Akzeptoren丙酮酸或乙酸丁酯在BZW的基础上。生理学研究表明，黄素是一种不可理解的物质。在中华儿科大学硕士学位论文中，对其同工酶进行了氨基酸测定，并对其进行了调节。她说：“这是一件非常重要的事情。”在新陈代谢抑制和除草剂抑制的情况下，他们不能从机械师那里获得更多的信息。我们用核磁共振波谱分析中间体检测了所有的酶活性。这是一种新的方法，所有的中间产物都是硫胺素和硫胺素的中间产物。他说：“这是一件非常重要的事情，因为这是一件非常重要的事情。”在此期间，动态核磁共振和停流研究是传递信息的一种方式，它传递了一种信息，即在化学体系中传递了一种新的调节者的身份和特征。我们在唯一的合作伙伴之间建立了良好的关系，他们显然是捐赠者和受赠者，也不是所有人中的一员。本文从热力学和动力学的角度分析了黄素因子的内在联系和生理反应。他说：“这是一件非常重要的事情，因为这是一件非常重要的事情。”