Aufklärung der Katalysemechanismen und Regulation der bakteriellen Acetohydroxysäuresynthasen auf molekularer Ebene

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Im Gegensatz zum tierischen Organismus können Pflanzen und Bakterien die verzweigtkettigen Aminosäuren Valin, Leucin und Isoleucin sowie das daraus abgeleitete Coenzym A de novo synthetisieren. Der erste Schritt der komplexen Reaktionskaskade wird dabei von der Acetohydroxysäuresynthase (AHAS) katalysiert. Die AHAS besteht aus zwei katalytischen und zwei regulatorischen Untereinheiten und hat im aktiven Zentrum die Cofaktoren Thiamindiphosphat und FAD gebunden. Am Thiamin-Cofaktor erfolgt die enantioselektive Ligation vom Donorsubstrat Pyruvat mit den alternativen Akzeptoren Pyruvat oder Ketobutyrat unter Bildung von Acetolaktat bzw. Acetohydroxybutyrat. Die Rolle des an der physiologischen Reaktion unbeteiligten Flavins ist bis dato unverstanden. Zwei der in summa drei bakteriellen Isoenzyme werden durch die Aminosäure Valin nach Bindung an die regulatorische Untereinheit im Sinne einer Feedback- Inhibierung gehemmt. Eine Reihe von kommerziell genutzten Herbiziden unterschiedlicher Wirkstoffklassen sind hocheffiziente Inhibitoren der AHAS. Ziel unserer Untersuchungen ist die Aufklärung der Mechanismen von Katalyse und Regulation durch Metabolitrepression und Herbizidinhibitoren auf molekularer Ebene. Zu diesem Zweck sollen die mikroskopischen Geschwindigkeitskonstanten aller enzymatischen Teilschritte durch eine neuartige NMR-spektroskopische Intermediatanalysemetnode bestimmt werden. Diese Methode stellt zur Zeit die einzige Möglichkeit dar, alle Intermediate der katalytischen Sequenz Thiamin-abhängiger Enzyme simultan und direkt zu delektieren. Die vermutlicherweise veränderte Verteilung von Reaktionsintermediaten in Anwesenheit von Effektoren erlaubt daher erstmals Rückschlüsse darauf, in welcher Art sich die inhibitorische Wirkung von Valin bzw. Herbiziden auf katalytischer Ebene manifestiert. Durch i) kinetische NMR und stopped-flow Studien an Enzymvarianten mit Aminosäureaustauschen im aktiven Zentrum und in der valinbindenden regulatorischen Untereinheit und ii) Röntgenkristallographie des Holoenzymkomplexes sollen sowohl die an der Bindung der Effektoren als auch die am Informationstransfer vom regulatorischen zum aktiven Zentrum beteiligten Aminosäureseitenketten identifiziert und ein chemisches Modell für die Effektorwirkung vorgeschlagen werden. Weiterhin soll untersucht werden, welche Aminosäureseitenketten die hohe Enantioselektivität und hohen apparenten Spezifitäten für Donor- und Akzeptorsubstrat bestimmen, da die Substrat-Präferenz der AHAS entscheidend für das relative Konzentrationsverhältnis der verschiedenen verzweigtkettigen Aminosäuren in der Zelle ist. Die intrinsische Reaktivität und katalytische Kompetenz des an der physiologischen Reaktion unbeteiligten Flavincofaktors soll durch Bestimmung des Mittelpunkt-Redoxpotentials und der thermodynamischen und kinetischen Stabilisierung von radikalischen Flavinsemiquinon-Spezies analysiert werden. Diese Ergebnisse versprechen Aufschluss darüber, in welcher Art die Enzymkomponente die Reaktivität eines Cofaktors kinetisch und/oder thermodynamisch unterdrückt, um eine konkurrierende Parallelreaktion zu favorisieren.