Echtzeitbeobachtung des Doppelmotors in einer einzelnen F0F1-ATP Synthase: Abbilden von Rotor-Elastizität und Stator-Nachgiebigkeit anhand von Dreifarben-FRET

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Untersuchungen am einzelnen Enzym erlauben die Identifikation von Subpopulationen im Fall einer heterogenen Verteilung enzymatischer Zustände, ohne die Notwendigkeit einer Synchronisation. FoF1-ATP Synthase katalysiert die Bildung von ATP in den Membranen der Mitochondrien, Chloroplasten und Bakterien. Die Synthese von ATP am F1-Teil des Enzyms ist mechanisch an den Transport von Protonen über die Membran durch den Fo-Teil gekoppelt. Es wird gegenwärtig angenommen, dass diese Kopplung durch zwei unterschiedliche Arten von Rotationsbewegungen innerhalb des Enzyms erfolgt. Verschiedene Hypothesen über diese Rotationsbewegungen zwischen und innerhalb der Untereinheiten wurden aufgestellt. Unter anderen sind zwei Fragestellungen unbeantwortet:Erstens, ist die Rotation eines Rings von c-Untereinheiten in Fo ein quasi-kontinuierliche Bewegung oder liegt eine schrittweise Bewegung vor, bzw. wie wird die 10-bis-14-fache Symmetrie durch die Anordnung der c-Untereinheiten in die dreifache (bzw. sechsfache) Symmetrie der Orientierungen der ¿-Untereinheit übersetzt ? Zweitens, kommt es während der Protonenaufnahme und -abgabe zu einer Hin-und-her-Bewegung ( swiveling ) in einer der beiden transmembranen Helices in derjenigen c-Untereinheit, die direkt zur a-Untereinheit benachbart ist? Ist diese Hin-und-her-Bewegung eine lokale Bewegungsart einer einzigen c-Untereinheit oder eine konzertierte Bewegung in allen c-Untereinheiten gleichzeitig ?Wir werden die Rotationsbewegungen einer c-Untereinheit innerhalb des Fo-Teils von FoF1-ATP Synthase aus Escherichia coli mithilfe eines zeitaufgelösten Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Experiments in 4¿-Konfiguration untersuchen. Um die Hin-und-her-Bewegung einer Helix innerhalb einer c-Untereinheit zu beobachten, wird das FRET Experiment mit einem Anisotropie-Experiment mit abwechselnd gepulster Anregung kombiniert. Dabei wird die polarisierte Fluoreszenz des einen Labels separat gemessen, sowohl während ATP Hydrolyse als auch ATP Synthese.