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Exploration and biochemical characterization of novel regulatory mechanisms of bacterial glutamate dehydrogenases

细菌谷氨酸脱氢酶新调控机制的探索和生化表征

基本信息

批准号：
21K05358
负责人：
富田武郎
金额：
$ 2.75万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

グルタミン酸脱水素酵素GDHはグルタミン酸と2-オキソグルタル酸の可逆的変換を触媒する酵素であり、ほとんど全ての生物において炭素・窒素代謝の恒常性の維持において重要な役割を果たしている。我々は以前に好熱菌Thermus thermophilus由来のGDH (TtGDH)が複雑なアロステリック活性化を受けることを発見した。本研究では、このGDHの活性化の構造基盤を明らかにする共に、別の微生物のGDHにおける新奇活性調節機構を探索し、細胞内機能を解明することを目指した。TtGDH複合体のクライオ電顕解析を行い、3.6Å分解能のデータを得た。最終年度はこのデータに基づき各コンポーネントの間の相互作用部位の変異体解析を行った。その結果、これらのタンパク質の間の特定のイオン結合が相互作用の鍵となっていることが明らかとなった。また、我々は分裂酵素の2種類のGDHに着目した。そのうち一つのSpGDH1はNADPH依存型酵素である。我々は、SpGDH1の補酵素・基質複合体の結晶構造を決定し、補酵素認識機構を明らかにした。SpGDH1の補酵素特異性はリン酸化修飾により制御されている可能性が考えられた。リン酸化模倣変異体を解析したところ、補酵素特異性がシフトしていることがわかった。最終年度では、分裂酵母内で実際にSpGDH1がリン酸化されていることを確認するために、分裂酵母の組換え株を作製した。他方のSpGDH2はサブユニットのサイズが約115 kDaと大きいタイプのGDHである。コアGDHドメインの他に大きな機能未知ドメインを有していることなどから、複雑な調節機構が存在することが予想された。大腸菌を用いてSpGDH2の組換えタンパク質を調製し、その酵素活性を確認した。最終年度では、クライオ電顕解析により3.6Å分解能のデータを得て複雑なドメイン構造を形成していることが明らかになった。

The acid dehydrase GDH, the acid dehydrase, the acid, the acid, the acid, The cause of Thermus thermophilus is GDH (TtGDH), replication, activation, activation, replication, replication, activation, activation, replication, replication, activation, replication, replication, activation, replication, activation, activation, replication, replication, activation, activation, replication, replication, activation, activation, replication, activation, replication, activation, activation, replication, replication, activation, activation, replication, activation, activation, replication, replication, activation, activation, replication, replication, activation, activation, replication, replication, activation, activation, replication, replication, activation, activation, replication, replication, activation, activation, In this study, GDH activating agents and microorganisms were used to explore novel bioactive mechanisms, and intracellular machines were able to understand the target indicators of microorganisms. The TtGDH complex was used to analyze the computer, and the decomposition of 3.6k could be successfully performed. The most important part of the year is the volume analysis of the interaction site. The results show that the results show that the interaction between the specific data and the interaction between the two groups is not clear. We focus on the GDH of mitozyme 2. SpGDH1-dependent enzyme-dependent enzymes were isolated from each other. In our laboratory, the SpGDH1 enzyme-based combination system is used to determine the determination of the enzyme, and the enzyme research institute is responsible for the determination of the enzyme system. SpGDH1 enzyme properties, acidizing, modification, control, control, possibility, and feasibility. The acidizing mold is used to analyze the specific properties of enzymes and enzymes. In the most recent year, the yeast SpGDH1 was acidified and the yeast strain was made sure that the yeast strain was isolated. The other party said that SpGDH2 would have to pay a price of about 115kDa per day, so that the GDH would be fine. If you are not aware of the possibility that you may have a copy of the GDH, you may have a copy of the computer or copy the computer. Aspergillus SpGDH2 was used to determine the activity of enzymes. For the most recent years, the most recent annual electrical analysis and thermal analysis of electrical equipment and electronic equipment can be easily replicated and reproduced in order to form an environmental protection system.