Study on the regulation of SPAM1-ARSA complexes associated with the reduction of polyspermy during in vitro fertilization of porcine oocytes

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前年度の研究により，IVF培地へ添加したエラグ酸は，その強い抗ヒアルロニダーゼ作用により透明帯へ結合した精子の先体反応誘起を阻害させる機序を介して，多精子受精を効果的に抑制することが明らかとなった。したがって，今年度は，精子のSPAM1-ARSA複合体のARSAに着目し，媒精前の卵子に5 mU/mL sulfatase処理を施すことで，ARSAと卵透明帯の硫酸化糖鎖との結合を阻害し，効果的な多精子受精の抑制が可能か否かを検討した。IVF後の受精パラメーターでは，10分間のsulfatase処理区で精子侵入率を低下させることなく多精子受精率が無処理区(52.1%)より有意に低下した(25.0%)。また，透明帯結合精子数がsulfatase処理で変化することは無かった。同様に，sulfatase処理を施した裸化卵の透明帯溶解に要する時間についても有意差は見られず，sulfataseによる多精子受精抑制効果は透明帯硬化によるものではないと判断された。次に，卵活性化に伴う透明帯構成糖タンパク質の変化について，sulfatase処理による相違があるか否かを調査した。その結果，経時的なプロテアーゼ消化試験では，両処理区ともに活性化処理直後から2.5時間までの間と比較し，3から4時間までの間に透明帯溶解に要する時間の有意な増加が認められた。同様に，ビオチン化標識ZP1 + ZP2バンドの検出強度にも両処理間に有意差はなく，それぞれ活性化処理3時間後に有意に減少した。すなわち，sulfataseの多精子受精抑制効果は，透明帯硬化や透明帯構成糖タンパク質の異常な変化によるものではないと確認された。以上の結果から，ブタIVF時のsulfataseを用いた多精子受精抑制法としては，媒精前の裸化卵に対しての10分間のsulfatase処理が最も効果的であると考えられた。