新規カニクイザル発生工学技術を用いた栄養膜特異的ノックアウト法の開発

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今年度はまず、昨年度に作製したCRISPR/Cas9条件付きノックアウトベクターの機能を、培養細胞とマウス個体において検証した。まずは培養細胞においてノックアウトの誘導精度とノックアウト効率を検証した。その結果、"漏れ"によるノックアウトはほとんど生じないことが判明した。また、ベクターを保持する細胞においては誘導依存的に少なくとも90%以上という高い効率でノックアウトを実行可能であることが確認できた。実際に、機能未知な6つの遺伝子座を標的としてノックアウト実験を実施し、1つの遺伝子が細胞増殖に寄与する可能性を見出すことに成功した。続いて、CRISPR/Cas9条件付きノックアウトベクターを保持するトランスジェニックマウスを作製した。出生後個体の全身臓器の解析を実施した結果、ノックアウト非誘導下においてもノックアウトが生じている個体が存在した。従って、マウス個体に適用するためにはより"漏れ"の少ない改良型のベクターを用いることが重要であると考えられ、現在作成を進めている。次に、我々が至適化した条件を用いて作出したトランスジェニックマウスの品質を検証した。まず、トランスジーンのコピー数をデジタルPCRを用いて解析した。また、細胞間のモザイク性を検証するため、シングルセルレベルでの解析を実施した。その結果、トランスジーンはほぼ全ての細胞で安定に発現することが確かめられ、ファウンダー世代で表現型解析を十分に実施可能であることが示された。