Roles and their molecular mechanisms of replication barrier zones programmed on chromosome for genome stability maintenance

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複製フォークはDNAを複製しながらゲノム上を進行する。この時、複製フォークでは、DNAポリメラーゼがチミンを含む4種類の基質を重合してDNAを合成する。チミンの欠乏状態では、この酵素反応の基質が一つ不足するために、複製フォークの進行が阻害される。それだけでなく、細胞が迅速に、かつ、急激に生存力を失う「チミン飢餓死」という現象を生じる。チミン飢餓死は今から60年以上前に発見され、この現象を起こす抗菌剤や抗がん剤が医療現場で長年広く使用されている。しかし、細胞内の複製フォークの動態が、微生物でも真核生物でもゲノム全体のレベルで明らかでないため、未だにチミン飢餓死のメカニズムは謎のままである。研究代表者は、チミン不足の大腸菌細胞で、複製フォーク進行がゲノムのどの位置でも同じように阻害されるのではなく、複製開始点oriCの両側近傍に位置する約200kbのゲノム領域（複製遅延領域FTZ: Fork Trapping Zone）で高頻度にに阻害されることを見出した。さらに、これらの二つのFTZで囲まれたoriC周辺領域はチミン飢餓死で消失するゲノムDNA領域と一致した。そこで、本研究では、「チミン不足時に、選択的にFTZで複製フォークの進行を阻害する仕組みと、その役割は何か」というオリジナルな問いに対する答えを明らかにして、チミン飢餓での複製阻害とゲノム不安定化のメカニズムの解明を目指す。これまでに、oriC左側のFTZ領域(L-FTZ)のコア領域を含む人工染色体(L-FTZ人工染色体)を構築した。また、複製フォークの解析を進めるために、このL-FTZ人工染色体を大腸菌の複製タンパク質を用いてセルフリー複製したり、大腸菌細胞内で安定に維持したりすることができた。さらに、複製フォークの動態をより詳細に解析するために、DNAポリメラーゼのゲノム分布を決定できる実験系を新たに構築した。