The use of nucleic acid aptamers as a removable masking agent for the controlled polymer modification of enzymes

使用核酸适体作为可去除的掩蔽剂来控制酶的聚合物修饰

• 批准号: 21K06522
• 负责人: 笹井 泰志
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Gihu University of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06522/
• 关键词: アプタマー; 酵素阻害剤; トリプシン; 酵素ー高分子コンジュゲート; 酵素－高分子コンジュゲート; 核酸アプタマー; 酵素; 高分子修飾酵素

高分子による酵素の修飾は、酵素の安定性改善、物性改善、および活性のON/OFF制御や環境応答性付与等の機能化に利用されている。一方で、酵素を化学的に高分子修飾すると、基質分子の酵素活性部位へのアクセスが修飾高分子によって妨害されるなどが原因で、酵素活性の低下が一般的に認められる。本研究では、高分子修飾する際の酵素活性部位のマスク剤として、酵素活性部位に対するアプタマーを用いる新たな高分子修飾法の開発を目的とするものである。令和４年度は、前年度より継続している課題として、酵素としてウシトリプシンを用い、そのアプタマー（Apt）の酵素阻害特性を詳細に検討した。Michaelis-Menten式に基づき、速度論的解析を実施したところ、使用したAptによる混合型阻害様式が示唆され、酵素阻害定数は、116 nMであった。また、Aptによる阻害時間にかかわらず、任意のタイミングでAptに対する相補的配列を有する一本鎖DNA（cApt）を添加することにより、トリプシン活性を回復させることができた。これは、AptとcAptを組み合わせることで酵素活性のOFF/ON制御が可能であることを示唆する結果である。Aptをマスク剤とするトリプシンの高分子修飾について、修飾高分子にpoly(N-isopropylacrylamide)を用いて検討したところ、Aptを用いない系と比較して、トリプシンの活性低下を抑制できることが示された。追加での検討が必要な状況ではあるが、アプタマーをリムーバブルマスク剤とすることで効果的に酵素の高分子修飾が可能である初期的知見を得ることはできた。

Modification of polymer enzymes, improvement of enzyme stability, improvement of physical properties, ON/OFF control of enzyme activity, environmental responsiveness, etc. On the one hand, enzyme chemical polymer modification, enzyme active site of matrix molecule, enzyme activity and other factors affecting polymer modification, enzyme activity and other factors are generally recognized. The purpose of this study is to develop a new method for polymer modification of enzyme active sites. In 2004, we conducted a detailed study on the enzyme resistance characteristics of the enzyme and its application in the previous year. Michaelis-Menten equation, velocity theory analysis, mixed resistance equation, enzyme resistance determination, 116 nM A DNA lock (cApt) is added to the DNA sequence of any of the three complementary sequences. The enzyme activity is controlled by OFF/ON control. The polymer modification of Apt and the polymer modification of poly(N-isopropylacrylamide) are discussed in detail in this paper. Add the necessary conditions for the study, such as enzyme modification, initial knowledge, etc.

项目成果

トリプシンに対する核酸アプタマーのリムーバブルマスク剤としての応用

核酸适体作为胰蛋白酶可去除掩蔽剂的应用

• 发表时间: 2023
• 作者: 笹井泰志;磯野蒼;近藤伸一
• 通讯作者: 近藤伸一

Characterization of a DNA Aptamer as a Removable Trypsin Inhibitor

DNA 适体作为可去除胰蛋白酶抑制剂的表征

• 发表时间: 2022
• 作者: Yasushi Sasai;Masao Morita;Aoi Isono;Shin-ichi. Kondo
• 通讯作者: Shin-ichi. Kondo