CRISPRスクリーニングによるTCR刺激依存的Tregエピゲノム制御因子の同定

転写因子Foxp3を発現した制御性T細胞(Treg)は広範な免疫抑制機能を示し、自己免疫寛容と免疫恒常性の維持に必須の役割を担っている。これまでにTregへの運命決定はFoxp3発現の有無ではなく、Foxp3遺伝子座のTreg-specific demethylation region[TSDR]と呼ばれる発現制御領域のDNA脱メチル化により補完されることが分かってきた。しかしながら、現時点でこのエピゲノム形成の分子基盤はほとんど明らかにされていない。そのため、例えばin vitroでナイーブT細胞からT細胞受容体（TCR）刺激とサイトカインTGF-βを与えることで誘導されるiTreg（in vitro-induced Treg）の培養系では、安定的なFoxp3発現を獲得した細胞を誘導することが出来ず、Tregを用いた細胞療法にとって大きな障害となっている。本研究はiTreg培養系において、TSDR脱メチル化に重要な分子をCRISPR-Cas9 sgRNAライブラリーによる網羅的なスクリーニングで同定することを目指す。そして、同定した標的因子を介して安定的にFoxp3発現を獲得したiTregを誘導し、治療応用への可能性を探索する。2022年度は、昨年度に引き続きCRISPR-Cas9 sgRNAライブラリーによるスクリーニングを可能にするiTreg培養系の確立を目指した。具体的には、sgRNAをレトロウイルス（RV）感染で導入後、iTreg培養を行い、誘導されたFoxp3陽性細胞を抗原提示細胞で再刺激を行うことで、Foxp3発現の有無によりTSDRがほぼ完全に脱メチル化した細胞集団とメチル化状態の細胞集団に分離することに成功した。従って、本培養系を用いてCRISPRスクリーニングが可能になると考えられる。

転写因子Foxp3を発現した制御性T細胞(Treg)は広範な免疫抑制機能を示し、自己免疫寛容と免疫恒常性の維持に必須の役割を担っている。これまでにTregへの運命決定はFoxp3発現の有無ではなく、Foxp3遺伝子座のTreg-specific demethylation region[TSDR]と呼ばれる発現制御領域のDNA脱メチル化により補完されることが分かってきた。しかしながら、現時点でこのエピゲノム形成の分子基盤はほとんど明らかにされていない。そのため、例えばin vitroでナイーブT細胞からT細胞受容体（TCR）刺激とサイトカインTGF-βを与えることで誘導されるiTreg（in vitro-induced Treg）の培養系では、安定的なFoxp3発現を獲得した細胞を誘導することが出来ず、Tregを用いた細胞療法にとって大きな障害となっている。本研究はiTreg培養系において、TSDR脱メチル化に重要な分子をCRISPR-Cas9 sgRNAライブラリーによる網羅的なスクリーニングで同定することを目指す。そして、同定した標的因子を介して安定的にFoxp3発現を獲得したiTregを誘導し、治療応用への可能性を探索する。2022年度は、昨年度に引き続きCRISPR-Cas9 sgRNAライブラリーによるスクリーニングを可能にするiTreg培養系の確立を目指した。具体的には、sgRNAをレトロウイルス（RV）感染で導入後、iTreg培養を行い、誘導されたFoxp3陽性細胞を抗原提示細胞で再刺激を行うことで、Foxp3発現の有無によりTSDRがほぼ完全に脱メチル化した細胞集団とメチル化状態の細胞集団に分離することに成功した。従って、本培養系を用いてCRISPRスクリーニングが可能になると考えられる。